Яңалыклар

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Активлаштырылган эфирларга яки фенокси радикалларга нигезләнгән энзиматик якынлык маркировкалау ысуллары тере күзәнәкләрдәге субсекуляр протеомнарны һәм протеин интеракторларын картада куллану өчен киң кулланыла.Ләкин, активлашкан эфирлар азрак реактив, нәтиҗәдә радиус киң, һәм пероксид белән эшкәртелгән фенокси радикаллар редокс юлларына комачаулый ала.Монда без miniSOG фотосенситизатор протеинын кызыклы протеин белән генетик яктан бәйләп эшләнгән бәйләнешле фотоактивация (PDPL) ысулы маркировкасы турында хәбәр итәбез.Зәңгәр ут белән тетрәндерелгән һәм экспозиция вакыты белән контрольдә тотылган кислород барлыкка килә, аннары анилин зонасы белән гистидин калдыкларын спатиотемпораль рәвештә чишүгә ирешәләр.Без аның югары тугрылыгын органеллга хас протеом картасы аша күрсәтәбез.PDPL-ны TurboID белән чагыштыру PDPL-ның конкрет һәм комплекслы протеомик яктыртуын күрсәтә.Алга таба, без PDPL авыруы белән бәйле транскрипцияле коактиватор BRD4 һәм E3 Паркин лигасына кулландык һәм элек билгесез интеракторлар таптык.Чиктән тыш кысу скринкасы ярдәмендә Паркин өчен ике билгесез субстрат, Ssu72 һәм SNW1 ачыкланды, аларның деградациясе увитуация-протеазома юлы белән арадашлашты.
Белгеч челтәрләренең төгәл характеристикасы күп фундаменталь кәрәзле процессларга нигезләнә.Шуңа күрә, протеинның үзара бәйләнешенең югары төгәл спатиотемпораль картасы биологик юлларны, авырулар патологиясен шифрлау һәм терапевтик максатларда үзара бәйләнешне бозу өчен молекуляр нигез бирәчәк.Моның өчен тере күзәнәкләрдә яки тукымаларда вакытлыча үзара бәйләнешне ачыклый алган ысуллар бик кирәкле.Якынлыкны чистарту масса спектрометриясе (AP-MS) тарихи яктан кызыклы протеиннарның (POI) бәйләнешле партнерларын ачыклау өчен кулланылган.Санлы протеомика ысулларын үстерү белән, Bioplex3.0, AP-MS нигезендә протеин челтәрләренең иң зур мәгълүмат базасы булдырылды.AP-MS бик көчле булса да, күзәнәк лизисы һәм эш процессындагы эретү адымнары зәгыйфь һәм вакытлы бәйләнешле үзара бәйләнештә торалар һәм лизиска кадәр компартизация булмаган парлы лизиздан соң ясалган экспонатлар кертәләр.
Бу проблемаларны чишү өчен, үзара бәйләнешле төркемнәр белән табигый булмаган аминокислоталар һәм якын-тирә маркировкалау (PL) платформалары (мәсәлән, APEX һәм BioID) 5 эшләнде.UAA ысулы күп сценарийларда уңышлы кулланылса да һәм туры протеин ябыштыргычлары турында мәгълүмат бирсә дә, UAA кертү урынын оптимизацияләү әле дә таләп ителә.Иң мөһиме, бу стохиометрик маркировкалау ысулы, анда маркировкалау вакыйгаларының катализатор кире әйләнеше юк.Моннан аермалы буларак, BioID методы кебек энзиматик ПЛ ысуллары инженер биотин лигасын POI7 белән кушалар, соңрак биотинны активлаштыралар, реактив биотинил-АМП эфиры.Фермент шулай итеп проксималь лизин калдыкларын билгеләгән активлашкан биотин “болыт” ны катализацияли һәм чыгара.Ләкин, BioID җитәрлек билгеле сигнал алу өчен 12 сәгатьтән артык вакыт таләп итә, бу вакытлы резолюция белән куллануны тыя.Чүпрә дисплейына нигезләнгән эволюция кулланып, TurboID BioID нигезендә эшләнде, биотин белән эффектив маркировкалауга мөмкинлек бирде, 10 минут эчендә динамик процессларны өйрәнергә мөмкинлек бирде.TurboID бик актив һәм эндоген биотин дәрәҗәсе түбән дәрәҗәдәге маркировкалар өчен җитәрлек булганлыктан, экзоген биотин кушылу белән югары көчәйтелгән һәм вакытлы маркировкалар таләп ителсә, фон маркировкасы потенциаль проблемага әйләнә.Моннан тыш, активлаштырылган эфирлар начар реактив (t1 / 2 ~ 5 мин), бу зур маркировкалау радиусына китерергә мөмкин, аеруча күрше протеиннарны биотин белән туендырганнан соң. фенол радикаллары һәм бер минут эчендә протеин маркировкасына мөмкинлек бирә 9,10. кәрәзле процесслар.
Шулай итеп, кәрәзле юлларны сизелерлек бозмыйча, югары киңлек һәм вакытлы төгәллек белән реактив маркалы радиусны кысу төрләрен барлыкка китерә алган яңа ысул гамәлдәге ысулларга мөһим өстәмә булачак. Реактив төрләр арасында бердәнбер кислород кыска гомере һәм чикләнгән диффузия радиусы аркасында игътибарыбызны уятты (күзәнәкләрдә t1 / 2 <0,6 µs) 13. Реактив төрләр арасында бердәнбер кислород кыска гомере һәм чикләнгән диффузия радиусы аркасында игътибарыбызны уятты (күзәнәкләрдә t1 / 2 <0,6 µs) 13. С адан активных формасы наше внимание привлек синглетный Кизод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузузии (t1 / 2 <0,6 мсек в клетках) 13. Актив формалар арасында бердәнбер кислород кыска гомере һәм чикләнгән диффузия радиусы аркасында игътибарыбызны җәлеп итте (күзәнәкләрдә t1 / 2 <0,6 µs) 13.在 活性 物质 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1/2 <0.6 µs） 而 引起 注意 注意 13 С адан активных форм наше внимание привлекает синглетный Кизод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузузии (t1 / 2 <0,6 мк в в клетках). Актив формалар арасында бердәнбер кислород кыска гомере һәм чикләнгән диффузия радиусы аркасында безнең игътибарыбызны җәлеп итә (күзәнәкләрдә t1 / 2 <0,6 μs).Бер кислород метионин, тиросин, гистидин һәм триптофанны ​​очраклы рәвештә оксидлаштыра, һәм аны амин яки тиол нигезендәге пробаларга бәйләү өчен 14,15 поляр итә.Бердәнбер кислород РНК субкуляр күзәнәк бүлеген куллану өчен кулланылса да, эндоген POI якынлык маркерларын кабатлау стратегиясе өйрәнелмәгән булып кала.Монда без фотоактивациягә бәйле якынлык маркировкасы (PDPL) дип аталган платформа тәкъдим итәбез, анда мин зәңгәр яктылык кулланып, миниСОГ фотосесизаторы белән кушылган POIларны яктыртабыз һәм проксималь калдыкларны оксидлаштыру өчен бердәнбер кислород җитештерүне башлыйбыз, аннары химик зоналарны оксидлаштыру өчен амин булган модификацияләр. арада тере күзәнәкләр..Без тег спецификасын максимумлаштыру өчен химик зоналар төркемен сынадык һәм ачык протеомика эш процессын кулланып модификация сайтларын билгеләдек.PDPL-ны TurboID белән чагыштыру PDPL-ның конкрет һәм комплекслы протеомик яктыртуын күрсәтә.Без бу ысулны субкуляр күзәнәк протеомының органелл специфик маркерларына һәм рак белән бәйле эпигенетик көйләүче протеин BRD4 һәм Паркинсон авыруы белән бәйле E3 лигасы Паркинга бәйләүче партнерларның гомуми протеом идентификациясенә кулландык, бу билгеле һәм билгесез белок челтәрен раслады. үзара бәйләнеш..PDPL-ның эре протеин комплексларында E3 субстратларын таный белү сәләте турыдан-туры бәйләүчеләрне тану таләп ителгән ситуацияне күрсәтә.Ике билгесез паркин субстратлары ситуада расланган.
Фотодинамик терапия (PDT) 19 һәм хромофор ярдәмендә лазерны инактивлаштыру (CALI) 20, анда фотосенситизаторлар белән якты нурланыш бердәнбер кислород барлыкка китерә, максатлы аксымнарны активсыз калдыра яки күзәнәк үлеменә китерә ала.Бердәнбер кислород теоретик диффузия дистанциясе белән бик реактив матдә булганлыктан, фотосенситизатор тирәсендә чикләнгән оксидлашуны контрольдә тотарга мөмкин.Бу концепциягә нигезләнеп, без тере күзәнәкләрдәге протеин комплексларына якын маркировкалау өчен бердәнбер кислород кулланырга булдык.Без дүрт функцияне үтәү өчен PDPL химопротеомик алым эшләдек: (1) ПЛ энзиматик карашына охшаган актив кислород барлыкка китерүне катализацияләү;2) яктылык башлангач вакыт белән чишелгән маркировкаларны тәэмин итү;3.
Фотосенситизаторларны ике категориягә бүлеп була, кечкенә молекуляр авырлыктагы флюорфорлар (мәсәлән, роза бенгал, метилен зәңгәр) 22 һәм генетик кодланган кечкенә протеиннар (мәсәлән, miniSOG, KillerRed) 23.Модульле дизайнга ирешү өчен, без POI24,25 фотосенситизатор (PS) белгечләрен өстәп, беренче буын PDPL платформасын эшләдек (1а рәсем).Зәңгәр яктылык белән нурланганда, бердәнбер кислород проксималь нуклеофил аминокислота калдыкларын оксидлаштыра, нәтиҗәдә электрофилик һәм амин зонасы нуклеофиллары белән реакциядә була ала.Прибор алкин тоткасы белән эшләнгән, химиягә басыгыз һәм LC / MS / MS характеристикасы өчен төшә.
МиниСОГ белән арадашлашкан протеин комплексларын маркировкалауның схематик иллюстрациясе.Зәңгәр яктылыкка эләккәндә, miniSOG-POI күрсәтүче күзәнәкләр бердәнбер кислород ясыйлар, ул үзара тәэсир итүче протеиннарны үзгәртә, ләкин бәйләүче протеиннар түгел.Фотококсидациянең арадаш продуктлары ковалент кушылмалар формалаштыру өчен амин химик зонаның эстафета этикеткалары белән тотыла.Химия зонасындагы алкинил группасы химияне баету өчен LC-MS / MS күләме белән баетырга мөмкинлек бирә.б 1-4 амин зоналарының химик төзелеше.в Митохондрия локальләштерелгән миниСОГ-арадаш протеомик маркерларга флюоресцент гел анализы, гель денситометриясе нигезендә чагыштырмача санлаштыру.Химик зоналарның сигнал-фон коэффициенты тискәре контроль экспериментлар ярдәмендә зәңгәр утны яки HEK293T күзәнәкләрен миниСОГ экспрессиясен кулланмыйча бәяләнде.n = 2 биологик бәйсез үрнәк.Eachәр нокта биологик репликаны күрсәтә.d PDPL вәкилләрен ачыклау һәм санлаштыру, c кебек күрсәтелгән PDPL компонентлары булганда яки булмаганда оптимальләштерелгән зонаны кулланып.n = 3 биологик бәйсез үрнәк.Eachәр нокта биологик репликаны күрсәтә.Centerзәк сызыклар һәм сызгырулар уртача һәм ± стандарт тайпылышны күрсәтәләр.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Ерак кызыл Si-DMA таплары белән бердәнбер кислородның конфокаль тасвирламасы.Масштаб сызыгы: 10 мм.Гель сурәтләү һәм конокаль экспериментлар охшаш нәтиҗәләр белән ким дигәндә ике тапкыр мөстәкыйль кабатланды.
Без башта HEK293T белән күрсәтелгән җитлеккән фотосенситизаторлар miniSOG26 һәм KillerRed23, протеомның химик тикшерү рәвешендә пропаргиламин маркировкасын арадашлау сәләтен сынадык (өстәмә рәсем 1а).Гел флуоресцент анализы күрсәткәнчә, протеом маркировкасы миниСОГ һәм зәңгәр якты нурланыш ярдәмендә ирешелгән, ләкин KillerRed белән билгеле маркировкалау продукты күзәтелмәгән.Сигнал-фон коэффициентын яхшырту өчен, без анилин (1 һәм 3), пропиламин (2) яки бензиламин (4) булган химик зоналар җыелмасын сынадык.Без HEK293T күзәнәкләренең зәңгәр фон белән чагыштырганда югарырак фон сигналына ия булуын күрдек, мөгаен, эндоген рибофлавин фотосенситизаторы, флавин мононуклеотид (FMN) 27 аркасында. Анилинга нигезләнгән химик зоналар 1 һәм 3 яхшырак үзенчәлек бирделәр, HEK293T митохондриядә миниСОГны тотрыклы итеп күрсәттеләр, 3-зонд өчен сигналның 8 тапкыр артуын күрсәтәләр, ә RNA-маркировкалау ысулында кулланылган CAP-seq ~ 2,5- күрсәтәләр. катлаулы сигнал арту, мөгаен, РНК һәм протеин арасындагы төрле реактивлык өстенлекләре аркасында (1б, с). Анилинга нигезләнгән химик зоналар 1 һәм 3 яхшырак үзенчәлек бирделәр, HEK293T митохондриядә миниСОГны тотрыклы итеп күрсәттеләр, 3-зонд өчен сигналның 8 тапкыр артуын күрсәтәләр, ә RNA-маркировкалау ысулында кулланылган CAP-seq ~ 2,5- күрсәтәләр. катлаулы сигнал арту, мөгаен, РНК һәм протеин арасындагы төрле реактивлык өстенлекләре аркасында (1б, с).Анилинга нигезләнгән химик зоналар 1 һәм 3 яхшырак үзенчәлекне күрсәттеләр: митохондриядә миниСОГны тотрыклы итеп күрсәтә торган HEK293T, 3-нче тикшерү өчен сигналның 8 тапкырга артуын күрсәтә, 2-нче тикшерү, CAP-seq RNA маркировкалау ысулында гына кулланыла. сигналның 2,5 тапкыр артуын күрсәтә, мөгаен, РНК һәм протеин арасындагы реактивлык өстенлекләре аркасында (1б, с).H HEK293T 在 线粒体 表达 表达 miniSOG ， 探针 3 的 增加 8> 8 倍 ， 用于 用于 RNA 标记 AP CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 由于 由于 由于 RNA 和 蛋白质 之间 图 b b b 1b ， c）。29 is 的 探针 和 和 k 29 29 29 29 29 is is is is is is is is is is is is is 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 - 倍 信号 增加 由于 由于 由于 RNAАнилинга нигезләнгән химик зоналар 1 һәм 3 яхшырак үзенчәлеккә ия, HEK293T митохондриядә миниСОГны тотрыклы итеп күрсәтте, һәм 3 нче зонада сигнал 8 тапкырга артты, CAP-seq RNA маркировкалау ысулы өчен 2 нче зонд ~ 2,5 тапкыр артуны күрсәтте.сигналда, мөгаен, РНК һәм протеин арасындагы реакция өстенлекләре аркасында (1б, с).Моннан тыш, 3 зонаның оптимизациясен раслаучы 3 изомер һәм гидразин зоналары (5, 6, 7) сынадылар (өстәмә рәсем 1б, с).Шулай ук, гельдәге флуоресцент анализ башка оптимальләштерелгән эксперименталь параметрларны ачыклады: нурланыш дулкын озынлыгы (460 нм), химик зонаның концентрациясе (1 мм), һәм нурланыш вакыты (20 мин) (өстәмә рәсем 2а - с).PDPL протоколындагы теләсә нинди компонентны яки адымны калдыру сигналның фонга кире кайтуына китерде (1-нче рәсем).Шунысы игътибарга лаек, бердәнбер кислородны сүндерә торган натрий азид яки тролокс булганда, протеин маркировкасы сизелерлек кимеде.Бер кислородны тотрыклыландыручы D2O булуы маркировкалау сигналын көчәйтә.Башка реактив кислород төрләренең маркировкаларга керткән өлешен тикшерү өчен, маннитол һәм С витамины гидроксил һәм супероксид радикал чүпрәкләр булдыру өчен кушылды, ләкин алар маркировканы киметү өчен табылмады.H2O2 өстәү, ләкин яктырту түгел, маркировкалауга китермәде (өстәмә рәсем 3а).Si-DMA зоналары белән флуоресцентлы кислород тасвирламасы HEK293T-miniSOG чыбыкында бердәнбер кислород булуын раслады, ләкин оригиналь HEK293T чыбыкта түгел.Моннан тыш, mitoSOX Red яктыртылганнан соң супероксид җитештерүне таба алмады (1-нче рәсем һәм өстәмә рәсем. 3б) 30. Бу мәгълүматлар бердәнбер кислородның төп реактив кислород төре булып, протеомик маркировкалар өчен җаваплы булуын күрсәтәләр.PDPL цитотоксиклыгы зәңгәр яктылык нурланышын һәм химик зоналарны кертеп бәяләнде, һәм мөһим цитотоксиклылык күзәтелмәде (өстәмә рәсем 4а).
Маркировкалау механизмын өйрәнү һәм LC-MS / MS ярдәмендә протеин комплексларын протеомик идентификацияләү өчен, безгә башта нинди аминокислоталарның үзгәртелүен һәм тикшерү этикеткаларының дельта массасын ачыкларга кирәк.Метионин, гистидин, триптофан һәм тиросин бердәнбер кислород белән үзгәртелгәнлеге хәбәр ителә14,15.Без TOP-ABPP31 эш процессын MSFragger32 нигезендә FragPipe исәпләү платформасы тарафыннан бирелгән ачык эзләү белән берләштерәбез.Бердәнбер кислород модификациясе һәм химик зоналар маркировкасыннан соң, химиягә чирттергеч бәйләүче булган биотин киметү этикеткасы ярдәмендә башкарылды, аннары нейтравидин сузылды һәм трипсин ашказаны.Resзгәртелгән пептид, әле дә резин белән бәйләнгән, LC-MS / MS анализы өчен фотоклевацияләнгән (2а рәсем һәм өстәмә мәгълүматлар 1).Протеомда күп санлы модификацияләр 50 дән артык пептид картасы (PSM) матчлары белән күрсәтелгән (2б рәсем).Гаҗәп, без гистидинның модификациясен күзәттек, мөгаен, оксидлаштырылган гистидинның анилин зоналарына карата реактивлыгы башка аминокислоталарга караганда.Бер кислород белән гистидинны оксидлаштыру механизмы буенча, тәкъдим ителгән дельта-масса структурасы 21,33, ике оксидлашканнан соң 2-оксо-гистидин белән 3 зонд кушылмасына туры килә, ә +247 Da - гидролиз продукты. +229 Да (өстәмә рәсем 5).MS2 спектрын бәяләү, y һәм b ионнарының күбесен ачыклауның югары ышанычлылыгын күрсәтте, шул исәптән үзгәртелгән фрагмент ионнарын (y һәм b) идентификацияләү (2 нче рәсем).PDPL-үзгәртелгән гистидиннарның җирле эзлеклелеген контекст анализлау small 1 позициядә кечкенә гидрофоб калдыкларына уртача мотив өстенлеген күрсәтте (өстәмә рәсем 4б).Уртача алганда, протеинга 1,4 гистидин ачыкланган, һәм бу маркерларның урыннары эретеп була торган өслек мәйданы (SASA) һәм чагыштырмача эретү мөмкинлеге (RSA) анализы белән билгеләнгән (өстәмә рәсем 4c, d).
MSFragger белән эшләнгән FragPipe исәпләү платформасы ярдәмендә калдык сайлап алуын өйрәнү өчен беркатлы эш процессы.Чистартыла торган бәйләүчеләр Стриптавидин резинасыннан үзгәртелгән пептидларны фотоклевацияләү өчен Click химиясендә кулланыла.Күп үзгәртүләрне, шулай ук ​​калдыкларны ачыклау өчен ачык эзләү башланды.b Протеомда булган үзгәртүләр массасын билгеләгез.Пептид картасы PSM.c Гистидин мәйданнарының MS2 спектраль аннотациясе. Зонд белән үзгәртелгән.d PDPL маркерларын сынау өчен кулланылган мутация анализы.PRDX3 (H155A, H225A) һәм PRDX1 (H10A, H81A, H169A) флагка каршы ачыклау өчен кыргый типтагы плазмидлар белән күчерелде.e Синтетик пептид чистартылган миниСОГ белән 3 запрос булганда реакцияләнде һәм LC-MS спектрында Δm +247 һәм +229 булган продуктлар искә алынды.f МиниСОГ-6хХис-тег һәм анти-6хХис антителасы белән модельләнгән витро белок-протеин үзара бәйләнеш.Антибиотин (стрептавидин-HRP) һәм тычканга каршы Көнбатыш блот анализы миниСОГ-6хХис / анти-6хХис антитела комплексларына яктылык тәэсир итү вакытына карап.Аерым протеиннар өчен ярлыклар тиешле молекуляр авырлыкта күрсәтелә: LC антитела яктылык чылбыры, HC антителасы авыр чылбыр.Бу экспериментлар охшаш нәтиҗәләр белән ким дигәндә ике тапкыр мөстәкыйль кабатланды.
Маркировкалау мәйданын биохимик тикшерү өчен, PRDX3 һәм PRDX1 масса спектрометрия белән билгеләнгән гистидиннан аланинга үзгәртелде һәм трансфекция анализларында кыргый тип белән чагыштырылды.PDPL нәтиҗәләре күрсәткәнчә, мутация маркировкаларны сизелерлек киметкән (2 нче рәсем).Шул ук вакытта, ачык эзләүдә ачыкланган пептид эзлеклелеге синтезланган һәм витрода чистартылган миниСОГ белән 3 зонасы һәм зәңгәр яктылык булганда реакцияләнгән, LC-MS ачыклаганда +247 һәм +229 Da масса сменасы булган продуктлар китерә (Рәсем) 2e).).Проксималь протеиннарның үзара тәэсире миниСОГ фотоактивациясенә җавап итеп витрода билгеле булырга мөмкинлеген тикшерү өчен, без miniSOG-6xHis протеины һәм витродагы Аның моноклональ антителасы белән үзара бәйләнештә ясалма якынлык анализы ясадык (2ф рәсем).Бу анализда без миниСОГ белән антитела авыр һәм җиңел чылбырларның проксималь маркировкасын көткән идек.Чынлыкта, анти-тычкан (анти-6xHis маркалы антителаның авыр һәм җиңел чылбырларын танып) һәм стрептавидин Көнбатыш блоклары авыр һәм җиңел чылбырларның көчле биотиниляциясен күрсәттеләр.Игътибар белән, без 6xHis теге һәм җиңел һәм авыр чылбырлар арасындагы үзара бәйләнеш аркасында миниСОГ автобиотиниляциясен күрдек, бу лизин белән 2-оксо-гистидин проксималь реакциясе арасындагы тасвирланган аерма белән бәйле булырга мөмкин.Ахырда, без нәтиҗә ясыйбыз: PDPL гистидинны якынлыкка бәйле рәвештә үзгәртә.
Киләсе максатыбыз - ситу маркировкасының үзенчәлеген сынау өчен субсекуляр протеомны характерлау иде.Шуңа күрә без миниСОГны ядрода, митохондрия матрицасында яки HEK293T күзәнәкләренең тышкы ER мембранасында күрсәттек (3а рәсем).Гел флуоресцент анализы өч субсекуляр урында күп маркалы полосаларны, шулай ук ​​төрле маркировкалау үрнәкләрен ачыклады (3б рәсем).Флуоресцент сурәтләү анализы PDPLның югары үзенчәлеген күрсәтте (3с рәсем).PDPL эш процессы флуоресцент микроскопия ярдәмендә субсекуляр протеомнарны аеру өчен родамин буяулары белән чирттерелгән реакцияләр белән тәмамланды, һәм PDPL сигналлары DAPI, митохондрия трекерлары яки ER трекерлары белән колокализацияләнде, бу PDPLның югары тугрылыгын раслады.Өч органель урыны өчен, PDPL-ны TurboID белән авидин көнбатыш блотын кулланып чагыштыру күрсәтте, PDPL үз контроле белән чагыштырганда аеруча билгеле.PDPL шартларында күбрәк PDPL маркалы протеиннарны күрсәтеп, күбрәк маркалы полосалар барлыкка килде (өстәмә рәсем 6а-д).
миниСОГ-арадаш органелле-махсус протеом маркировкасының схематик чагылышы.miniSOG митохондрия матрицасын N-терминалга кушылу аша кеше COX4 23 аминокислотасына (мито-миниСОГ), кушылу аша H2B (ядро-миниСОГ), һәм Sec61β ER мембранасының цитоплазмик ягы аша (ER-miniSOG) ).Күрсәткечләргә гель тасвирлау, конокаль сурәтләү һәм масса спектрометрия керә.b Өч органелле специфик PDPL профиленең гел рәсемнәре.CBB Coomassie Бриллиант Зәңгәр.в HEK293T күзәнәкләренең конфокаль образлары миниСОГны тотрыклы итеп күрсәтәләр, төрле субсекуляр локализацияләр белән V5 (кызыл) дип аталган антитела белән ачыкланган.Субкуляр маркерлар митохондрия һәм ER (яшел) өчен кулланыла.PDPL эш процессы Cy3-azide басу химиясе ярдәмендә миниСОГ (сары) маркалы субсекуляр протеомнарны табуны үз эченә ала.Масштаб сызыгы: 10 мм.d Төрле органеллларда PDPL тамгаланган протеомнарның вулкан участоклары билгесез сан белән бәяләнә (n = 3 бәйсез биологик экспериментлар).Ике койрыклы Студентның тесты вулкан участокларында кулланылды.HEK293T кыргый тип тискәре контроль буларак кулланылган. Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгы 2 тапкыр). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгы 2 тапкыр). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгында 2 тапкыр аерма).<着 变化 的 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 的 <<p <0.05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион көченең 2 тапкыр аермасы).HEK293T-miniSOG өчен мөһим, ләкин HEK293T өчен мөһим булмаган протеиннар яшел төстә күрсәтелгән.e Экспериментлардан протеомик мәгълүматлар базасының үзенчәлеген анализлау d.Organәр органелле (кызыл һәм яшел нокталар) статистик әһәмиятле аксымнарның гомуми саны югарыда билгеләнгән.Гистограммалар MitoCarta 3.0, GO анализы һәм А.Тинг һ.б. нигезендә органеллларда локальләштерелгән аксымнарны күрсәтәләр.кешеләр.Митохондрия, ядрәләр һәм ER өчен аерым мәгълүматлар базасы.Бу экспериментлар охшаш нәтиҗәләр белән ким дигәндә ике тапкыр мөстәкыйль кабатланды.Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.
Гель һәм сурәтләү нәтиҗәләре белән дәртләнеп, һәр органельдә билгеләнгән протеомны санау өчен ярлыксыз санлаштыру кулланылды (Өстәмә мәгълүмат 2).Сакланмаган HEK293T фон маркерларын алу өчен тискәре контроль буларак кулланылды. Вулкан сюжеты анализы бик баетылган аксымнарны күрсәтте (p <0.05 һәм> 2 тапкыр ион интенсивлыгы), шулай ук ​​миниСОГ-экспрессив сызыкларда булган бердәнбер протеиннар (3d рәсем кызыл һәм яшел нокталар). Вулкан сюжеты анализы бик баетылган аксымнарны күрсәтте (p <0.05 һәм> 2 тапкыр ион интенсивлыгы), шулай ук ​​миниСОГ-экспрессив сызыкларда булган бердәнбер протеиннар (3d рәсем кызыл һәм яшел нокталар). Аназа чикаика вулкана показал значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2-кратная интингность ионов), также одиночные белки, кута присутствуют только в чалиях, рисе зы. Вулкан сюжеты анализы шактый баетылган аксымнарны күрсәтте (p <0.05 һәм> 2 тапкыр ион интенсивлыгы), шулай ук ​​миниСОГ-экспрессив сызыкларда булган бердәнбер протеиннар (3d рәсем, кызыл һәм яшел нокталар).S 火山 图 在于 <<<<<0.05 在于 S S S 在于 S 在于 在于 在于 S 在于 在于 在于 S S S S 在于 S S 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 S 在于 在于 在于 在于Min is 图 在于 <0.05 0.05 <0.05 is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is is Аназа чикаика вулкана вявил значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2х ионная сила), также отдельные белки, присутствующие только всресрезной чирии миниСОГ (красные и зеленые точки). Вулкан сюжеты анализы шактый баетылган аксымнарны (p <0.05 һәм> 2x ион көче), шулай ук ​​миниСОГ экспрессия сызыгында булган бер протеиннарны ачыклады (3d рәсемдәге кызыл һәм яшел нокталар).Бу мәгълүматларны берләштереп, без 1364, 461, һәм 911 статистик яктан әһәмиятле атом, митохондрия һәм ER тышкы мембрана белгечләрен ачыкладык.Органелле-локальләштерелгән PDPL төгәллеген анализлау өчен, без MitoCarta 3.0, Ген Онтологиясе (GO) анализын кулландык, һәм А.Тинг һ.б.митохондрия, ядро ​​һәм ER өчен 734, 78.5, һәм 73,0% төгәллегенә туры килгән ачыкланган аксымнарның органелле үзенчәлеген сынау өчен мәгълүматлар җыелмасы кулланылды (3-нче рәсем).PDPL үзенчәлеге PDPLның органелле специфик протеомнарны ачыклау өчен идеаль корал булуын раслый.Шунысы игътибарга лаек, ачыкланган митохондрия белокларына субохондрия анализы күрсәткәнчә, капланган протеом матрицада һәм эчке мембранада таралган (тиешенчә 226 һәм 106), ачыкланган митохондрия аксымнарының 91,7% (362).PDPLның югары дәрәҗәсе өстәмә расланды (өстәмә рәсем 7а).Нәкъ шулай ук, суб-атом анализы күрсәткәнчә, алынган протеом нигездә ядрода, нуклеоплазмада һәм нуклеолда таралган (өстәмә рәсем 7б).Атом локализация сигналы пептиды (3xNLS) белән атом протеомик анализы H2B конструкциясенә охшаш төгәллек күрсәтте (өстәмә рәсем 7c - с).PDPL маркерының үзенчәлеген ачыклау өчен, атом ламинин A аеруча локальләштерелгән POI7 тозагы итеп сайланды.PDPL 36 баетылган аксымны ачыклады, шуларның 12 протеины (30,0% А ламинын да кертеп) яхшы характерлы ламин A үзара тәэсир итүче протеиннар, String мәгълүмат базасы белән аңлатылган, BioID ысулыннан (122 аксым) 28, 22.9. %) 7. Безнең ысул азрак протеиннарны ачыклады, мөгаен, маркировкаларның чикләнгән өлкәләре аркасында, алар активрак кислород ярдәмендә мөмкин булган.GO анализы күрсәткәнчә, ачыкланган протеиннар нигездә нуклеоплазмада (26), атом мембранасында (10), атом мембранасында (9) һәм атом күзәнәкләрендә (5) урнашкан.Коллектив рәвештә, бу атом-локальләштерелгән протеиннар баетылган аксымнарның 80% тәшкил итә, алга таба PDPL үзенчәлеген күрсәтә (өстәмә рәсем 8а - d).
ПДПЛның органеллларда якынлык билгеләрен ясый алу сәләтен булдырганнан соң, без PDPL POI бәйләүче партнерларны анализлау өчен кулланыла аламы-юкмы икәнен сынадык.Аерым алганда, без цитосолик протеиннарның PDPL анализын билгеләргә омтылдык, алар бик динамик табигате аркасында мембраналар-локальләштерелгән хезмәттәшләренә караганда катлаулырак максат булып санала.Бромодомейн һәм экстротерминаль (BET) белок BRD4 төрле авырулардагы төп роле өчен безнең игътибарыбызны җәлеп итте 35, 36.BRD4 формалашкан комплекс транскрипцияле коактиватор һәм мөһим терапевтик максат.C-myc һәм Wnt5a транскрипция факторларын күрсәтүне көйләп, BRD4 кискен миелоид лейкоз (AML), күп миелома, Буркитт лимфомасы, эчәк яман шеш авырулары һәм ялкынсыну авыруларының төп детеринанты булып санала.Моннан тыш, кайбер вируслар BRD4-ны папилломавирус, ВИЧ һәм SARS-CoV-236,39 кебек вируслы һәм кәрәзле транскрипцияне көйләү өчен максат итеп куялар.
PDPL ярдәмендә BRD4 үзара бәйләнешне картага китерү өчен, без miniSOGны кыска N- яки C-терминал BRD4 изоформасы белән берләштердек.Протеомик нәтиҗәләр ике конструктор арасында югары дәрәҗәдәге охшашлыкны күрсәттеләр (өстәмә рәсем 9а).MiniSOG-H2B белән билгеләнгән атом протеомы BRD4 белән үзара бәйләнештә булган протеиннарның 77,6% тәшкил итә (өстәмә рәсем 9б).Аннары, маркер радиусын көйләү өчен төрле яктырту вакытлары (2, 5, 10, 20 мин) кулланылды (4а рәсем һәм өстәмә мәгълүматлар 3).Без нәтиҗә ясыйбыз, кыска фотопериодларда PDPL беренче чиратта туры бәйләүче партнерларны билгеләячәк, ә озынрак вакыт кыска фотоактивация чорында билгеләнгән протеиннарны, шулай ук ​​маркировкалау комплексларында турыдан-туры максатларны кертәчәк.Чынлыкта, без күрше вакыт нокталары арасында нык охшашлык таптык (2 һәм 5 минутка 84,6%; 5 һәм 10 минутка 87,7%; 10 һәм 20 минутка 98,7%) (4б рәсем һәм өстәмә рәсем 9с).Барлык эксперимент төркемнәрендә без BRD4 үз-үзен маркировкалау гына түгел, ә MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, HMGB1 кебек билгеле максатларны таптык.Бу максатларның ион көче экспозиция вакытына пропорциональ (4с рәсем һәм өстәмә рәсем 9d).2 минутлык төркемдә ачыкланган протеиннарны GO анализы күрсәткәнчә, ачыкланган протеиннар ядрода локальләштерелгән һәм хроматин төзекләндерүдә һәм РНК полимераз функциясендә катнашкан.Протеинның молекуляр функциясе BRD4 функциясенә туры килгән хроматин бәйләүдә яки транскрипцияле коактивациядә баетылган (4 нче рәсем).Мәгълүматлар базасы ярдәмендә протеинның үзара бәйләнешен анализлау BRD4 һәм HDAC бәйләүче ацетилатланган гистоннар белән туры килгән SIN3A, NCOR2, BCOR, SAP130 (4e рәсем һәм өстәмә рәсем 9e) кебек BRD4 һәм HDAC гаилә үзара бәйләнеш комплекслары арасында турыдан-туры үзара бәйләнешнең беренче дәрәҗәсен ачыклады. ..Моннан тыш, LC-MS / MS тарафыннан билгеләнгән вәкиллекле максатлар, шул исәптән Sin3A, NSUN2, Fus, һәм SFPQ, Көнбатыш шартлаулары белән расланды (4ф рәсем).Күптән түгел, BRD4 кыска изоформасы сыек-сыек фазаны аеру (LLPS) үзлекләре белән ядрәләр барлыкка китерүе турында хәбәр ителде.Fus һәм SFPQ RNA бәйләүче протеиннар төрле кәрәзле процессларның LLPS арадашлашалар һәм монда теркәлмәгән BRD4 бәйләүче протеиннар дип билгеләнде.BRD4 һәм SFPQ арасындагы үзара бәйләнеш иммунопрекипитация (co-IP) экспериментлары белән расланды (рәсем 4г), BRD4-арадаш сыек-сыек фазаны аеруның тагын бер механизмын тәкъдим итә, алга таба тикшерүгә лаек.Бергә тупланган бу нәтиҗәләр PDPLның билгеле BRD4 үзара бәйләнешен, шулай ук ​​билгесез бәйләүче протеиннарны ачыклау өчен идеаль мәйданчык булуын күрсәтә.
miniSOG-арадашлы BRD4 якынлык билгесенең схематик чагылышы, экспозиция вакыты: 2, 5, 10, һәм 20 мин.b Төрле яктырту вакытында билгеләнгән аксымнарның каплануы.HEK293T-miniSOG-BRD4 белән билгеләнгән протеиннарны баету кыргый типтагы HEK293T белән чагыштырганда статистик яктан мөһим иде.в Билгеләнгән экспозиция вакытында билгеле BRD4 бәйләүче протеиннарны билгеләгәндә ион интенсивлыгы.n = 3 биологик бәйсез үрнәк.Мәгълүматлар уртача ± стандарт тайпылыш рәвешендә күрсәтелә.d 2 минутлык төркемдә ачыкланган протеиннарның ген онтологик анализы.Беренче ун GO термины күрсәтелгән.Күпчелек терминнар GO термины буенча төсле, һәм күпернең зурлыгы һәр терминда табылган аксымнар санына пропорциональ.e BRD4 белән үзара бәйләнештә булган протеиннарга анализ.Сары түгәрәкләр туры клей, соры түгәрәкләр - турыдан-туры клейның беренче катламы.Кызыл сызыклар эксперименталь рәвештә билгеләнгән үзара бәйләнешне, зәңгәр сызыклар алдан әйтелгән үзара бәйләнешне күрсәтәләр.f LC-MS / MS белән билгеләнгән BRD4 вәкиллекле максатлары Көнбатыш блотлау белән расланган.g Ко-иммунопрекипитация экспериментлары SFPQ һәм BRD4 арасындагы үзара бәйләнешне раслый.Бу экспериментлар охшаш нәтиҗәләр белән ким дигәндә ике тапкыр мөстәкыйль кабатланды.Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.
Теркәлмәгән POI белән бәйле максатларны ачыклау белән беррәттән, без PDPL ферментлар өчен субстратларны ачыклау өчен яраклы булыр дип фаразлыйбыз, бу теркәлмәгән субстратларны аңлату өчен зур комплексларда турыдан-туры бәйләүче белгечләргә характеристика таләп итә.Паркин (PARK2 белән кодланган) - E3 лигасы һәм паркиндагы мутацияләр билгеле, автосомаль рецессив балигъ булмаган Паркинсон авыруы (AR-JP) 42.Моннан тыш, паркин митофаги (митохондрия автофагы) һәм реактив кислород төрләрен бетерү өчен кирәк дип сурәтләнде.Ләкин, берничә паркин субстратлары ачыкланса да, бу авыруда паркинның роле аңлашылмый кала.Аның характеризацияләнмәгән субстратларын аңлату өчен, PDPL паркинның N- яки C-терминусына миниСОГ кушып сынады.Күзәнәкләр карбонил цианид протон ташучы м-хлорофенилгидразон (CCCP) белән эшкәртелде, PINK1-Паркин юлы аша паркинны активлаштыру.Безнең BRD4 PDPL нәтиҗәләре белән чагыштырганда, паркин N-терминус кушылуы зуррак максатлы протеиннар җыелмасын ачты, гәрчә ул C-терминусның зур өлешен каплаган булса (210 арасыннан 177) (5а рәсем, б һәм өстәмә мәгълүматлар 4).Нәтиҗә N-терминал Паркин44ны активлаштыра ала дигән хәбәрләр белән туры килә.Гаҗәп, безнең мәгълүматларда Паркин43 өчен бастырылган AP-MS нәтиҗәләре белән 18 өстәмә протеин булган, мөгаен, күзәнәк линиясе һәм протеомика эш процессы арасындагы аерма аркасында.Ике ысул белән билгеләнгән дүрт белгечкә (ARDM1, HSPA8, PSMD14, PSMC3) өстәп (5с рәсем) 43.LC-MS / MS нәтиҗәләрен тагын да раслау өчен, PDPL дәвалау һәм аннан соң Көнбатыш блотлау HEK293T төп күзәнәк анализы нәтиҗәләрен һәм тотрыклы N-терминал паркин сызыгын чагыштыру өчен кулланылды.Элегерәк билгесез максатлар CDK2, DUT, CTBP1, һәм PSMC4 билгеле бәйләүче, DNAJB1 белән сынадылар (5d рәсем).
HEK293T күзәнәкләрендәге паркин-үзара тәэсир итүче протеиннарның вулкан сюжеты тотрыклы күрсәтелгән миниСОГ белән паркинның N- яки C-терминусына кушылган (n = 3 бәйсез биологик экспериментлар).Ике койрыклы Студентның тесты вулкан участокларында кулланылды.HEK293T тискәре контроль буларак кулланылды. Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгы 2 тапкыр). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгы 2 тапкыр). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион интенсивлыгында 2 тапкыр аерма).<着 变化 的 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 的 <<p <0.05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Зур үзгәртелгән аксымнар кызыл төстә күрсәтелә (p <0.05 һәм> ион көченең 2 тапкыр аермасы).HEK293T-miniSOG өчен мөһим, ләкин HEK293T өчен мөһим булмаган протеиннар яшел төстә күрсәтелгән.b Вен схемасы N-терминал һәм C-терминал конструкцияләре арасында кабатланган протеиннарны күрсәтә.N-терминал теглары паркинны актив рәвештә активлаштырырга һәм танылган аксымнарга китерергә мөмкин.c PDPL һәм AP-MS арасында бер-берсенә капланган протеиннарны күрсәтүче Вен схемасы.Билгеле интеракторлар исемлеккә кертелгән, шул исәптән 18 өстәмә протеинның 4е һәм PDPLда махсус билгеләнгән 159 протеинның 11е.d LC-MS / MS белән билгеләнгән вәкиллекле максатлар Көнбатыш блотлау белән расланды.e Ssu72 һәм SNW1 теркәлмәгән паркин субстратлары итеп билгеләнде.Бу FLAG тамгаланган протеин плазмидлары HEK293T һәм HEK293T-Паркин-миниСОГка күчерелде, аннары төрле вакыт пунктларында CCCP дәвалау.Паркинның чиктән тыш кысылу сызыгында деградация ачык күренә.f MG132 протеазома ингибиторы кулланып, Ssu72 һәм SNW1 деградация процессы протеазома-увитуация белән арадашлашуы расланды.Бу экспериментлар охшаш нәтиҗәләр белән ким дигәндә ике тапкыр мөстәкыйль кабатланды.Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.
Шунысы игътибарга лаек, PDPL белән билгеләнгән протеиннар паркин бәйләүче протеиннарны һәм аларның субстратларын кертергә тиеш.Теркәлмәгән паркин субстратларын ачыклау өчен, без ачыкланган җиде аксымны сайладык (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 һәм SNW1) һәм бу геннарны нормаль HEK293T тәэсиренә китерү өчен плазмидлар күчердек һәм миниСОГ-Паркинның HEK293T белән тотрыклы рәвештә белдердек.Ssu72 һәм SNW1 аксымнары дәрәҗәсе тотрыклы миниСОГ-Паркин сызыгында сизелерлек кимеде (5e рәсем).CCCP белән 12 сәгать дәвалау ике субстратның да иң зур деградациясенә китерде.Ssu72 һәм SNW1 деградациясе протеазома-увитуация белән көйләнгәнме-юкмы икәнлеген тикшерү өчен, протеазома ингибиторы протеазома эшчәнлеген тыю өчен өстәлде, һәм без аларның деградация процессы тыелганын таптык (5ф рәсем).Өстәмә субстрат булмаган максатлар LC-MS / MS белән эзлекле нәтиҗәләр күрсәткән Көнбатыш блотлау (өстәмә рәсем 10) кулланып Паркин интеракторы буларак расланды.Ахырда, PDPL эш процессының максатлы протеин трансфекциясен тикшерү белән интеграцияләнмәгән E3 лигаз субстратларын ачыкларга мөмкинлек бирә.
Без гомуми якынлыкны билгеләү платформасын эшләдек, бу сезгә космоста һәм POI белән үзара бәйләнештә танышырга мөмкинлек бирә.Платформа миниСОГ фотосенситизатор протеинына нигезләнгән, ул якынча 12 kDa, җиткән APEX2 ферментының яртысыннан кимрәк (27 kDa) һәм TurboID зурлыгының өчтән бере (35 kDa).Кечкенә зурлык кечкенә протеин интерактомнарын өйрәнү өчен кушымталар спектрын киңәйтергә тиеш.Бердәнбер кислородның квант җитештерүчәнлеген арттыру һәм бу ысулның сизгерлеген киңәйтү өчен, генетик кодланган аксымнар яки кечкенә молекулалармы, өстәмә фотосенситизаторларны алга таба тикшерү кирәк.МиниСОГның хәзерге версиясе өчен якынлык маркерларын активлаштыру өчен зәңгәр яктырту ярдәмендә югары вакытлы резолюциягә ирешеп була.Моннан тыш, озынрак экспозиция вакыты зуррак кислородның "болытын" чыгарды, нәтиҗәдә дисталь гистидин калдыклары үзгәртелде, маркировкалау радиусы артты, һәм PDPL киңлек резолюциясен көйләү мөмкинлеге.Без шулай ук ​​сигнал-фон коэффициентын арттыру өчен җиде химик пробаны сынадык һәм бу ысул артындагы молекуляр механизмны өйрәндек.TOP-ABPP эш процессы бертигез ачык эзләү белән берлектә модификацияләрнең гистидиннарда гына булганын раслады һәм гистидин модификациясен арттыру өчен эзлекле микроэнергетика күзәтелмәде, цикл өлкәсендә гистидиннар өчен уртача өстенлектән кала.
PDPL шулай ук ​​субсекуляр протеомнарны протеом спецификасы һәм каплау белән характерлау өчен кулланылган, ким дигәндә башка якынлык маркировкасы һәм органеллга хас химик тикшерү ысуллары белән чагыштырыла.Якынлык маркерлары шулай ук ​​өслекне, лизосомаль һәм секретом белән бәйле протеомнарны характерлау өчен уңышлы кулланылган46,47.PDPL бу субсекуляр органелллар белән туры килер дип ышанабыз.Моннан тыш, без PDPL белән цитосолик протеин бәйләү максатларын ачыклап, мембраналар белән бәйләнгән протеиннардан катлаулырак, аларның динамик характеристикалары һәм вакытлыча үзара бәйләнештә катнашулары аркасында катлауландык.PDPL ике протеинга кулланылды, BRD4 транскрипцияле коактиватор һәм авыру белән бәйле E3 Паркин.Бу ике протеин төп биологик функцияләре өчен генә түгел, ә клиник актуальлеге һәм терапевтик потенциалы өчен дә сайланган.Бу ике POI өчен танылган бәйләүче партнерлар, шулай ук ​​теркәлмәгән максатлар билгеләнде.Шунысы игътибарга лаек, фазаны аеру белән бәйле протеин SFPQ co-IP белән расланды, бу BRD4 (кыска изоформа) LLPS көйли торган яңа механизмны күрсәтә ала.Шул ук вакытта, без Паркин субстратларын идентификацияләү - турыдан-туры ябыштыргычларны ачыклау таләп ителгән сценарий дип саныйбыз.Ике билгесез паркин субстратын ачыкладык һәм аларның деградациясен расладык - протеазома юлында.Күптән түгел гидролаз субстратларын ферментлар белән каплап, механизмга нигезләнгән каплау стратегиясе эшләнде.Бу бик көчле ысул булса да, ул зур комплекслар формалашуда катнашкан субстратларны анализлау өчен яраксыз һәм фермент белән субстрат арасында ковалент бәйләнешләр формалаштыруны таләп итә.PDPL бүтән протеин комплексларын һәм фермент гаиләләрен өйрәнү өчен киңәйтелер дип көтәбез, мәсәлән, деубикуитиназ һәм металлопротеаз гаиләләре.
SOPP3 дип аталган миниСОГның яңа формасы кислород җитештерүне яхшырту белән эшләнде.Без миниСОГны SOPP3 белән чагыштырдык һәм маркировкаларның яхшыруын таптык, гәрчә сигнал-шу коэффициенты үзгәрешсез кала (өстәмә рәсем 11).Без фаразладык, SOPP3 оптимизациясе (мәсәлән, юнәлешле эволюция аша) эффектив фотосенситизатор белгечләренә китерәчәк, алар кыска вакыт таләп итә һәм шулай итеп динамик кәрәзле процессларны кулга алырга мөмкинлек бирә.Шунысы игътибарга лаек, PDPLның хәзерге версиясе кәрәзле мохит белән чикләнә, чөнки ул зәңгәр яктылык яктыртуны таләп итә һәм тирән тукымаларга үтеп керә алмый.Бу үзенчәлек хайваннар моделен өйрәнүдә куллануны тыя.Ләкин, оптогенетиканың PDPL белән кушылуы хайваннарны тикшерү өчен, бигрәк тә баш миендә мөмкинлек бирә ала.Моннан тыш, башка инженер инфракызыл фотосенситизаторлар да бу чикләнүне бетерәләр.Хәзерге вакытта бу өлкәдә тикшеренүләр алып барыла.
HEK293T күзәнәк линиясе ATCC (CRL-3216) дан алынган.Күзәнәк линиясе микоплазма инфекциясе өчен тискәре сынады һәм DMEM (Термо, # C11995500BT) культурасында 10% фетал бавыры серумы (FBS, Vistech, # SE100-B) һәм 1% пенициллин / стрептомицин (Гиклон, # SV30010) белән эшкәртелде.үскән.
3-Аминофенилен (үрнәк 3) һәм (4-этинилфенил) метанамин (4 үрнәк) Бидефармнан сатып алынган.Пропиламин (зонд 2) Энергия-химикатлардан алынган.N- (2-Аминофенил) пент-4-ышанычлы (тикшерү 1) бастырылган ысуллар буенча синтезланган.
Өстәмә таблицада бу тикшерүдә кулланылган генетик конструкцияләр күрсәтелгән.МиниСОГ һәм KillerRed эзлеклелеге П. Зудан (Пекин Университеты) бүләк плазмидыннан клонланган.Митохондрия матрицасы эзлеклелеге 23 N-терминаллы COX4 аминокислоталарыннан алынган һәм Gibson җыелмасы ярдәмендә күрсәтелгән векторларга клонланган (Бейотим, # D7010S).Эндоплазмик ретикулум мембранасын һәм ядрәсен максат итү өчен, SEC61B кеше ДНКсы (NM_006808.3) (NEB, # M0491L) HEK293T күзәнәкләренең cDNA китапханәсеннән PCR көчәйтелгән, һәм H2B DNA (Д. Лин, Шэньчжэнь лабораториясе бүләк иткән) һәм югарыда әйтелгәнчә клонланган.Башкача күрсәтелмәгән булса, тотрыклы күзәнәк линияләрен күчерү һәм төзү өчен кулланылган башка белок геннары PCR HEK293T күзәнәк cDNA китапханәсеннән көчәйтелде.G3S (GGGS) һәм G4S (GGGGS) җим протеины һәм миниСОГ арасында бәйләүче буларак кулланылды.Бу кушылу конструкцияләренә V5 эпитоп тэге (GKPIPNPLLGLDST) өстәлде.Имезүчеләрдә белдерү һәм тотрыклы күзәнәк сызыгы булдыру өчен, миниСОГ кушылу конструкциясе pLX304 лентивираль векторына бүленде.Бактерияле белдерү өчен, миниСОГ C-терминалда 6xHis дип язылган pET21a векторына клонланган.
HEK293T күзәнәкләре алты кое тәлинкәләрдә 2,0 х 105 күзәнәккә чәчелгәннәр һәм 24 сәгатьтән соң рекомбинант лентивираль плазмидлар (2,4 μg pLX304) һәм вируслы упаковка плазмидлары (1,5 μg psPAX2 һәм 1,2 μg pMD2.G) Lipo8000 (Beyotime) ярдәмендә күчерелгән. , # C0533), якынча 80% кушылу.Төнге трансфекциядән соң, медиа үзгәртелде һәм тагын 24 сәгать инкубацияләнде.Вирус җыю 24, 48 һәм 72 сәгатьтән соң үткәрелде.Максатлы күзәнәк линияләрен инфекцияләгәнче, вируслы матдә 0,8 мм фильтр аша чистартылды һәм Мерк, # миллекс-GP) һәм полибрен (Соларбио, # H8761) 8 μг / мл концентрациясенә кушылды.24 сәгатьтән соң күзәнәкләргә уртача үзгәртеп торгызырга рөхсәт иттеләр.Күзәнәкләр 5 μг / мл бластикидин (Соларбио, 35 3513-03-9) ярдәмендә сайланганнар, иң түбән сайлау өчен.Аннары киләсе өч өзек өчен катырак режим буларак 20 μг / мл кулланды.
Күзәнәкләр 12 кое палатасында (Ибиди, 81 81201) якынча 20000 күзәнәк тыгызлыгында чәчелгән.HEK293T күзәнәкләренең ябышуын яхшырту өчен, 37 ° C температурада фосфат буферланган тозда (ПБС, Сангон, # B640435) эретелгән 50 µг / мл фибронектин (Корнинг, 35 356008) кушыгыз.Палаталар 1 сәгать алдан эшләнде, аннары ПБС белән алынды.24 сәг. ).) бүлмә температурасында 10 минутка нурландырылды.Аннан соң, күзәнәкләр ПБС белән ике тапкыр юылды һәм 4% формалдегид белән ПБС (Сангон, # E672002) бүлмә температурасында 15 минутка урнаштырылды.Артык формальдегид тотрыклы күзәнәкләрдән ПБС белән өч тапкыр юылып алынды.Соңыннан күзәнәкләр 0,5% Triton X-100 (Сангон, # A600198) белән пермэбилизацияләнде һәм ПБС белән 3 тапкыр юылды.Аннары палатаны алып, һәр үрнәккә 50 µM Cy3-азид (Аладдин, # C196720), 2 мм CuSO4 (Сангон, # A603008), 1 мм BTTAA (Конфлюор, # BDJ-4) кушылган реакция катнашмасына кушыгыз. һәм 0,5 мг / мл натрий аскорбаты (Аладдин, S105024) һәм бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләнгән.Тизрәк реакциядән соң, күзәнәкләр 0,05% Tween-20 (Сангон, # A600560) (ПБСТ) булган ПБС белән алты тапкыр юылды, аннары бүлмә температурасында 5 минут BSA (Abcone, # B24726) белән блокланды.
Колокализация иммуностина өчен күзәнәкләр күрсәтелгән шартлар буенча төп антителалар белән инкубацияләнделәр: тычканга каршы V5 теге mAb (1: 500, CST, # 80076), Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, # A0564), куян поликлональ анти-калнексин антителасы (1: 500, Абкам, # ab22595) яки куян анти-ламин A / C моноклональ антитела (1: 500; CST, 20 2032) төнлә 4 ° C температурада.ПБСТ белән 3 тапкыр юылганнан соң, күзәнәкләр икенчел антителалар белән инкубацияләнделәр: куянга каршы Alexa Fluor 488 (Термо, # A11034) 1: 1000, кәҗәгә каршы Alexa Fluor 594 (CST, 88 8889) 1: 1000 эретелгән.эретү 30 минут эчендә бүлмә температурасында эретегез.Соңыннан күзәнәкләр ПБСТ белән 3 тапкыр юылды һәм бүлмә температурасында 10 минут эчендә DAPI (Термо, # D1306) белән контрастировать ителде.ПБС белән 3 юылганнан соң, күзәнәкләр сурәтләү өчен ПБСта 50% глицеролда (Сангон, # A600232) мөһерләнгән.Иммунофлюорсент рәсемнәр ZEISS LSM 900 Airyscan2 конфокаль микроскоп һәм ZNE 3.5 программалары ярдәмендә алынган.
Бердәнбер кислород флуоресцент күзәтү өчен, күзәнәкләр Hanks HEPES буферы белән ике тапкыр юылган, Hanks HEPES буферына 100 nM Si-DMA кушылганчы (DOJINDO, # MT05).Яктылыкка тәэсир иткәч, күзәнәкләр CO2 инкубаторында 37 ° C 45 минут эчендә инкубацияләнделәр.Соңыннан күзәнәкләр ике тапкыр Hanks 'HEPES буферы белән юылды һәм Ханкның HEPES буферында Hoechst белән 10 минут бүлмә температурасында контрастировать ителде һәм ZEISS LSM 900 конфокаль микроскоп ярдәмендә визуальләштерелде., # M36008) кальций һәм магний булган HBSS буферында.Яктылыкка яки доксорубицинга (MCE, # HY-15142A) тәэсир иткәч, күзәнәкләр CO2 инкубаторында 37 ° C 10 минут эчендә инкубацияләнде, HBSS буферы белән ике тапкыр юылды, һәм Hoechst белән HBSS буферында бүлмә температурасында инкубацияләнде.минут.Доксорубицин уңай тикшерү контроле буларак кулланылган, анда күзәнәкләр HBSSда 20 μM доксорубицин белән эшкәртелгән, 30 минут эчендә 1% BSA булган.Иммунофлюорсент рәсемнәр Zeiss LSM 900 конфокаль микроскоп ярдәмендә алынган.
HEK293T күзәнәкләре тотрыклы рәвештә мито-миниСОГны күрсәтәләр, 15 см савытта якынча 30% тыгызлыкта чәчтеләр.48 сәг. температура..Аннан соң, күзәнәкләр ике тапкыр ПБС белән юылды, кырылды һәм бозлы салкын ПБС буферында EDTAсыз протеаз ингибиторы булган (MCE, # HY-K0011).Күзәнәкләр очны 1 минутка соникатлаштырып лизизацияләнделәр (1 секундта һәм 35% амплитудада 1 секундта).Нәтиҗә ясалган катнашма 15,871 xg белән 10 минутта 4 ° C чүп-чардан арындырылды, һәм супернант концентрациясе BCA белок анализлау комплекты ярдәмендә 4 мг / млга көйләнде (Бейотим, # P0009).1 мл югарыдагы лизатны 0,1 мм фотодеградацияләнә торган биотин азиды белән кушыгыз (Конфлюор, # BBBD-14), 1 мм TCEP (Сангон, # A600974), 0,1 мм ТБТА лиганы (Аладдин, # T162437), һәм 1 мм CuSO4 инкубаторы белән. бүлмә температурасында 1 сәгатькә әйләнү.Тизрәк реакциядән соң, катнашманы алдан катнаш эремәгә кушыгыз (MeOH: CHCl3: H2O = 4 мл: 1 мл: 3 мл) 10 мл пыяла касәдә.Samрнәкләр катнаш һәм центрифуга белән 4500 г бүлмә температурасында 10 минутка.Аскы һәм өске эремәләр ташланды, явым-төшем 1 мл метанол белән ике тапкыр юылды һәм 15871 × г центрифуга белән 5 минутта 4 ° C.25 мм аммиак биарбонатына (АБС, Аладдин, A110539) 1 мл 8 М карбамид (Аладдин, U111902) кушыгыз.Mрнәкләр 10 мм дитиотрейтол белән (Сангон, 25 мм ABCда # A100281) 40 минутта 55 минутта реконструкцияләнде, аннары караңгыда бүлмә температурасында 15 мм яңа йодоцетамид (Сангон, # A600539) кушылды.Алкиляция 30 минут эчендә..Реакцияне туктатыр өчен өстәмә 5 мм дитиотрейтол кушылды.1 мл ПБС белән 3 тапкыр юып, һәр үрнәк өчен якынча 100 µl NeutrAvidin агароза бусы (Термо, 29 29202) әзерләгез.Aboveгарыдагы протеом эремәсе 5 мл ПБС белән эретелде һәм алдан юылган NeutrAvidin агароза бусы белән бүлмә температурасында 4 сәгать инкубацияләнде.Моннан соң бусы 3 тапкыр 5 мл ПБС белән 0,2% SDS (Сангон, # A600485), 3 тапкыр 1М карбамид булган 5 мл ПБС белән, 3 тапкыр 5 мл ddH2O белән юылды.Моннан соң мончалар центрифугация белән җыеп алынды һәм 200 мм 25 мм ABCда 1 М карбамид, 1 мм CaCl 2 (Маклин, # C805228) һәм 20 нг / μл трипсин (Промега, # V5280) реанимацияләнде.Төнлә 37 ° C температурада әйләнү белән трипсинизацияләгез.Реакция pH 2-3 җиткәнче формаль кислотаны (Термо, # A117-50) кушып туктатылды.Мончалар 3 тапкыр 1 мл ПБС белән 0,2% SDS булган, 3 тапкыр 1 мл карбамид булган 1 мл ПБС белән, аннары 3 тапкыр 1 мл дистилляцияләнгән су белән юылган.Modifiedзгәртелгән пептидлар җиңел лизис (365 нм) белән 90 минутка 200 μл 70% MeOH кулланып чыгарылды.Centентрифугациядән соң супернант җыелды.Моннан соң бусы 100 μл 70% MeOH белән бер тапкыр юылды һәм супернантлар җыелды.Samрнәкләр Speedvac вакуум концентраторында киптерелгән һәм анализга кадәр -20 ° C сакланган.
Кислород үзгәртелгән пептидларны ачыклау һәм бәяләү өчен, үрнәкләр 0,1% форм кислотасында эретелде һәм 1 μг пептидлар Орбитрап Fusion Lumos Tribrid масса спектрометры ярдәмендә анализланды, Тун һәм Xcalibur сатучы программа тәэминаты нано ESI чыганагы белән җиһазландырылган.Samрнәкләр 75 µm × 15 см эчендә пакетланган капилляр колоннасында 3 µm C18 материалы белән аерылды (ReproSil-pur, # r13.b9.) Һәм EASY-nLC 1200 UHPLC системасына (Термо) тоташтырылды.Пептидлар сызыклы 95 минутлык градиент хроматография белән 8% эретүче Вдан 50% эретүче В (А = 0,1% форм кислотасы, 80% ацетонитрилда B = 0,1% форм кислотасы) белән аерылды, аннары турыдан-туры 98% B минутка кадәр артты. 6 минутта 300 нл / мин.Orbitrap Fusion Lumos мәгълүматларга карап тулы MS сканерлау һәм MS2 сканер арасында чиратлашып мәгълүмат җыя.Тавыш көчәнеше 2,1 кВ итеп, ион транспорт капиллярының температурасы 320 ° C.MS спектры (350-2000 м / з) 120,000 резолюция, AGC 4 × 105, һәм максималь кертү вакыты 150 мс.Fullәр тулы сканерда иң еш очрый торган 10 тапкыр корылган прекурсорлар HCD ярдәмендә 30% нормальләштерелгән бәрелеш энергиясе, 1,6 м / з дүртполлы изоляция тәрәзәсе һәм 30,000 резолюция параметры белән бүленде.5 × 104 һәм максималь кертү вакыты 150 мс кулланып тандем масса спектрометриясе өчен AGC максаты.Динамик искәрмә 30 секундка куелган. MS / MS өчен бирелмәгән ионнар яки 1+ һәм> 7+ зарядлы булганнар кире кагылды. MS / MS өчен бирелмәгән ионнар яки 1+ һәм> 7+ зарядлы булганнар кире кагылды. Неназначенные ионы или ион с сярядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS өчен 1+ һәм> 7+ зарядлы билгеләнмәгән ионнар яки ионнар кире кагылды.+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ион с сарядами 1+ и> 7+ былы отклонены для МС / МС. MS / MS өчен 1+ һәм> 7+ зарядлы билгесез ионнар яки ионнар кире кагылды.
Чимал мәгълүматлары MSFragger нигезендә FragPipe исәпләү платформасы ярдәмендә эшкәртелә.Масса-күләм тискәре күренешләр һәм тиешле аминокислоталар -150 - 500 Да прекурсор масса толерантлыгы булган ачык эзләү алгоритмы ярдәмендә билгеләнде.Соңыннан үзгәртелгән пептидлар гистидин модификациясе ярдәмендә ачыкланды, массакүләм табыш белән +229.0964 һәм +247.1069 Da PD (Proteome Discoverer 2.5, Термо).
Берләштерелгән миниСОГ генын тотрыклы итеп күрсәтүче күзәнәкләр 6 см савытта капланган.% 80% кушылуга җиткәч, күзәнәкләр HBSS белән бер тапкыр юылды (Gibco, 140 14025092), аннары HBSS-та химик зоналар белән 1 сәгать 37 ° C температурада инкубацияләнде һәм зәңгәр ут белән яктыртылды.Бүлмә температурасында 20W LED 10 минут.PDPL, 0,5 мм С витамины (MCE, # HY-B0166), 5 мм тролокс (MCE, # HY-101445), D2O (Сигма, 77 7789-20-0) нинди реактив кислород төрләренең катнашуын ачыклау өчен. Күзәнәкләргә өстәмә буларак 100 мм маннитол (Энергия Химиясе, 69 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 мм NaN3 кушылды.Салкын ПБС белән юылганнан соң, күзәнәкләр кырылганнар, 1,5 мл центрифуга торбаларында җыелганнар, һәм 1 минутка 200 μл ПБСта 1х протеаз ингибиторы белән EDTAсыз (1 с һәм 1 с, амплитуда 35%).Нәтиҗә ясалган катнашма 15,871 × г 10 минутта 4 ° C температурада центрифугацияләнде һәм супернанат концентрациясе BCA белок анализлау комплекты ярдәмендә 1 мг / млга көйләнде.Aboveгарыда күрсәтелгән лизатның якынча 50 µл 0,1 мм родамин азиды белән инкубацияләнде (Аладдин, 13131368), 1 мм TCEP, 0,1 мм ТБТА лиганы, һәм 1 мм CuSO4 бүлмә температурасында түбәннән өскә әйләнү белән 1 сәгать.Басу реакциясеннән соң, ацетон белән явым-төшем үрнәкләргә 250 μл алдан суытылган ацетон кушып, 20 минутта -20 ° C инкубацияләү һәм 6010 × г 10 минутта 4 ° C температурада центрифугация белән башкарылды.Пелетны җыеп, 50 µл 1х Лаеммли буферында 10 минутта 95 минутта кайнатырга.Аннары үрнәкләр SDS-PAGE озын гельләрдә анализланды һәм Bio-rad ChemiDoc MP Touch сүрәтләү системасы ярдәмендә Image Lab Touch программасы ярдәмендә визуальләштерелде.
Рекомбинант миниСОГ-6хХ протеинын күрсәтү һәм чистарту алда әйтелгәнчә башкарылды.Кыскасы, E. coli BL21 (DE3) күзәнәкләре (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xH белән үзгәртелде һәм протеин экспрессиясе 0,5 мм IPTG белән ясалды (Сангон, # A600168).Күзәнәк лизисыннан соң, протеиннар Ni-NTA агароза бусы (MCE, 66 70666) ярдәмендә чистартылды, ПБСка каршы диализланды һәм –80 ° C сакланды.
Антитело нигезендә витро этикеткасына якынлык анализы өчен, 100 μM чистартылган миниСОГ, 1 мм зонасы 3, һәм 1 μг тычканга каршы тычкан моноклональ антитела (TransGen, # HT501-01) гомуми реакция күләменә 50 μл..Реакция катнашмасы зәңгәр температурада 0, 2, 5, 10, һәм 20 минутта бүлмә температурасында нурландырылды.Бу катнашма 0,1 мм биотин-PEG3-азид (Аладдин, # B122225), 1 мм TCEP, 0,1 мм ТБТА лиганы, һәм 1 мм CuSO4 белән өске хәрәкәт тетрәүдә бүлмә температурасында инкубацияләнде.Тизрәк реакциядән соң, катнашмага 4х Лаеммли буферын кушыгыз һәм 95 минутта 10 минут кайнатыгыз.SDS-PAGE гельләрендә үрнәкләр анализланды һәм стрептавидин-HRP белән көнбатыш блотлау белән анализланды (1: 1000, Соларбио, # SE068).
Г-гидидинлы синтетик пептид C-терминал амидациясе белән (LHDALDAK-CONH2) витро маркировкасында урнашкан пептидны анализлау өчен кулланылды.Бу анализда 100 μM чистартылган миниСОГ, 10 мм зонасы 3 һәм 2 μг / мл синтетик пептид ПБСта гомуми реакция күләмендә 50 μл катнашында катнаштылар.Реакция катнашмасы зәңгәр температурада 1 сәгать бүлмә температурасында нурландырылды.Бер микролитер үрнәге LC-MS системасы ярдәмендә анализланган (Су, SYNAPT XS Ions Mobility очыш масса спектрометры MassLynx спектр анализлау программасы белән).
HEK293T күзәнәкләре миниСОГ кушылу генын тотрыклы итеп күрсәтәләр, 10 см савытта төрле органелл локализациясе (Mito, ER, Nucleus) һәм Паркин-миниСОГ һәм BRD4-miniSOG линияләре өчен 15 см савыт-саба чәчтеләр.% 90% кушылуга җиткәч, күзәнәкләр HBSS белән бер тапкыр юылды, аннары HBSS 3 зонасы белән 1 сәгать 37 ° C инкубацияләнде һәм бүлмә температурасында 10 Вт зәңгәр LED белән яктыртылды.Паркинның контактсыз маркировкасы өчен 10 µM протон карбонил цианид ташучы м-хлорофенилгидразон CCCP (Соларбио, # C6700) HBSS 3 зонасы белән 1 сәгать 37 ° C өстәлде.Күзәнәк лизизы, химиягә басыгыз, кыскарту һәм алкиляция адымнары югарыда әйтелгәнчә бер үк иде, 2 мг лизат өстәлде һәм биотин PEG3 азиды фотодеградацияләнгән биотин азиды урынына басу реакциясендә кулланылды.Бәйләгәннән соң, бусы 5 тапкыр 5 мл ПБС белән 0,2% SDS, 3 тапкыр 5 мл ПБС белән 1 М карбамид, 3 тапкыр 5 мл ПБС белән юылган.Аннан соң, 300 µл 25 мм АБСка 2 µг трипсин кушылды, протеинны төнлә 37 ° C ка чистарту өчен 1 М карбамид булган.Реакция формаль кислотаны кушып, 2-3 pH җиткәнче туктатылды.Мончаларда трипсинизациядән соң, пептид эремәсе SOLAµ HRP баганасы (Дермо, 60 60209-001) ярдәмендә сусызландырылды һәм Speedvac вакуум концентраторында киптерелде.Пептидлар 0,1% форм кислотасында эретелгән һәм 500 нг пептидлар югарыда тасвирланган нано-ESI чыганагы белән җиһазланган Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масса спектрометры ярдәмендә анализланган.Пептидлар коммерция RP-HPLC преколоннарында (75 μm x 2 см) (Термо, 49 164946) һәм аналитик RP-HPLC баганаларында (75 μm x 25 см) (Термо, 49 164941) аерылды, икесе дә 2 мм белән тутырылды.60 минутта 8% тан 35% ACN градиент, аннары сызыклы рәвештә 98% B ка кадәр 6 минутта 300 Nl / мин.MS спектры (350-1500 м / з) 60,000 резолюция, AGC 4 × 105, һәм максималь кертү вакыты 50 мс.Сайланган ионнар HCD тарафыннан 3 s циклында 30% нормальләштерелгән бәрелеш энергиясе, 1,6 м / з дүртполлы изоляция тәрәзәсе һәм 15000 резолюциясе белән эзлекле рәвештә бүленәләр. 5 × 104 тандем масса спектрометры AGC максаты һәм максималь инъекция вакыты. 22 мс кулланылган.Динамик чыгару 45 секундка куелган. MS / MS өчен бирелмәгән ионнар яки 1+ һәм> 7+ зарядлы булганнар кире кагылды. MS / MS өчен бирелмәгән ионнар яки 1+ һәм> 7+ зарядлы булганнар кире кагылды. Неназначенные ионы или ион с сярядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS өчен 1+ һәм> 7+ зарядлы билгеләнмәгән ионнар яки ионнар кире кагылды.+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ион с сарядами 1+ и> 7+ былы отклонены для МС / МС. MS / MS өчен 1+ һәм> 7+ зарядлы билгесез ионнар яки ионнар кире кагылды.
NeutrAvidin бусы баетуга кадәр үрнәк әзерләү адымнары югарыда тасвирланган LC-MS / MS анализындагы кебек иде.Якынча контроль йөкләү өчен якынча 50 μг лизат һәм басу реакцияләре өчен 2 мг лизат кулланылды.Нейтравидин белән баетылганнан һәм юылганнан соң, бәйләнгән протеиннар 50 μл Лаеммли буферын агароза чайырларына кушып, 95 ° C кайнап 5 минут кайнаттылар.Контроль йөк кертү һәм мишәр белән баетылган үрнәкләр SDS-PAGE белән анализланды һәм PVDF мембраналарына (Миллипор, # ISEQ00010) стандарт Көнбатыш блок ысуллары белән күчерелде.Мембраналар 5% сөт белән (Сангон, # A600669) TBS эчендә 0,1% -20 (TBST) булган һәм эзлекле рәвештә беренчел һәм икенчел антителалар белән инкубацияләнгән.Беренчел антителалар 1: 1000 TBST-та 5% эре сөттә эретелде һәм төнлә 4 ° C инкубацияләнде.Икенчел антителалар 1: 5000 нисбәтендә кулланылды һәм бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләнде.Мембраналар chemiluminescence белән Chemidoc MP сурәтләү системасы ярдәмендә визуальләштерелгән.Рәсемдәге блоклар һәм гельләрнең барлык киселмәгән сканерлары чимал итеп күрсәтелгән.
Бу тикшеренүдә кулланылган беренчел антителалар арасында куянга каршы SFPQ моноклональ антитела (КСТ, 99 71992), куянга каршы FUS моноклональ антитела (КСТ, 67 67840), куян анти-NSUN2 поликлональ антитела (Протеинтех, 85 20854-1-). AP), куян анти-mSin3A поликлональ антитела (Абкам, # ab3479), тычканга каршы моноклональ антитела (TransGen, # HT201-02), тычканга каршы β-актин моноклональ антитела (TransGen, # HC201-01), куян анти -CDK2 моноклональ антитела (ABclonal, # A0094), CTBP1 (ABclonal, # A11600) куян моноклоналы антителасы, куян поликлональ антителасы DUT (ABclonal, # A2901), куян поликлональ антителасы PSMC4 (ABclonal, # A2505), куян анти- DNAJB1 поликлональ антитела (ABclonal, # A5504).Бу антителалар TBST-та 5% эре сөттә 1: 1000 эретүдә кулланылган.Бу тикшеренүдә кулланылган икенчел антителалар 1: 5000 эритмәсендә куянга каршы IgG (TransGen, # HS101-01), тычканга каршы IgG (TransGen, # HS201-01) кертте.
Алга таба BRD4 SFPQ белән үзара бәйләнештә булу-булмавын тикшерү өчен, HEK293T һәм BRD4-miniSOG күзәнәкләре чиктән тыш кысылган HEK293T 10 см савытта салынган.Күзәнәкләр салкын ПБС белән юылганнар һәм 1 мл Пирс IP лизис буферында (Термо Фишер, 87 87787) EDTAсыз протеаз ингибиторы белән 30 минутта 4 ° C температурада лизизацияләнгәннәр.Аннан соң, лизатлар 1,5 мл центрифуга торбаларында җыелганнар һәм центрифуга 15,871 xg 10 минутта 4 ° C.Супернатант җыеп алынды һәм 5 µг анти-V5 маркалы тычкан моноклоналы антитела (CST, # 80076) белән төнлә 4 ° C температурада инкубацияләнде.Якынча 50 µл протеин A / G магнит мишәрләрен (MCE, # HY-K0202) 0,5% Tween-20 булган ПБС белән ике тапкыр юыгыз.Аннары күзәнәк лизатлары 4 ° C температурада 4 сәгать дәвамында астыннан өскә әйләнү белән инкубацияләнделәр.Аннары бусы дүрт тапкыр 1 мл ПБСТ буферы белән юылды һәм 95 минутта 5 минут кайнатылды.SDS-PAGE гельләрендә үрнәкләр анализланды һәм Көнбатыш блот ысулларын кулланып PVDF мембраналарына күчерелде.Мембраналар TBST-та 5% сөттә блокланганнар һәм беренчел һәм икенчел антителалар белән эзлекле инкубацияләнгәннәр.Беренчел антитела куян анти-SFPQ моноклональ антитела (CST, 71 71992) 1: 1000 нисбәтендә кулланылды, 5% эре сөттә TBST һәм төнлә 4 ° C инкубацияләнде.Куянга каршы IgG 1: 5000 нисбәтендә кулланылды һәм бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләнде.Мембраналар chemiluminescence белән Chemidoc MP сурәтләү системасы ярдәмендә визуальләштерелгән.
Solvent Accessible Surface Area (SASA) анализы өчен кулланылган барлык структуралар Протеин Мәгълүмат Банкыннан (PDB) 52 яки AlphaFold Протеин Структурасы Мәгълүматлар базасыннан алынган.Абсолют SASA FreeSASA программасын кулланып, һәр калдык өчен исәпләнде.Histәрбер структура өчен уртача SASA алу өчен гистидин һәм аның күршеләре өчен тулы һәм бертөрле SASA мәгълүматлары кулланылды.Histәрбер гистидин өчен чагыштырмача эретү мөмкинлеге (RSA) абсолют SASA кыйммәтен эмпирик максималь калдык өслеге мәйданына бүлеп исәпләнде.Барлык гистидиннар яшерен RSA 20% тан түбән булса, яшерен классификацияләнделәр, югыйсә 56.
DDA режимында алынган чимал файллары Proteome Discoverer (v2.5) яки MSfragger (Fragpipe v15.0) ярдәмендә гомуми пычраткыч матдәләр булган SwissProt тикшерелгән протеин базасында эзләнде.Пептидлар тулы трипсинны югалткан ике ярылу урыны белән, карбамойл метилизациясен тотрыклы модификация һәм динамик модификация буларак метионин оксидлаштыруны таләп иттеләр.Прекурсор һәм фрагмент авырлыгына толерантлык, тиешенчә, 10 ppm һәм 0.02 Da (MS2 Orbitrap) итеп куелган. Пычраткыч хитлар алынды, һәм белгечләр <1% ялган табыш алу өчен фильтрланды. Пычраткыч хитлар алынды, һәм белгечләр <1% ялган табыш алу өчен фильтрланды. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфиль чвваня, ч ч полы получить коэффентент ложного обнаружения <1%. Пычраткыч хитлар алынды һәм белгечләр фильтрланган, ялган ачыклау дәрәҗәсе <1%.去除 污染物 命中 1 1 1 <1% 的 错误 发现 率。 <1% 的 错误 发现 率。 Попадания загрязняющих веществ былы удалены, а белки отфиль чвваня для достижения оровня ложных обнаружений <1%. Пычраткыч хитлар алынды һәм ялган позитив дәрәҗәгә ирешү өчен протеиннар фильтрланды.Этикеткалар кулланмыйча санлы анализ өчен, өч биологик кабатлаудан нормальләштерелгән протеин кулланылды.Протеин субсекуляр локализация анализы DAVID биоинформатика ресурслары, MitoCarta 3.0 һәм Элис Тинг төркеме тарафыннан тупланган һәм бастырылган мәгълүматлар базасы Ген Онтологиясе (GO) анализы ярдәмендә башкарылды.Вулкан картасы Персейдан алынган (v1.6.15.0). Протеиннарның муллыгы үзгәреше статистик әһәмияткә ия булган, ике яклы т-тест кулланып, һәм протеин хитлары муллык үзгәреше белән билгеләнде> 2 (башкача әйтелмәгән булса) һәм p бәясе <0.05. Протеиннарның муллыгы үзгәреше статистик әһәмияткә ия булган, ике яклы т-тест кулланып, һәм протеин хитлары муллык үзгәреше белән билгеләнде> 2 (башкача әйтелмәгән булса) һәм p бәясе <0.05. Изменения кратности содержания белка былы проверены на статистическую значимость с использованием дву чононнего т-критерия, и совпадения белков былы идентифицирован с изменением содержя> 2 Протеин эчтәлеген үзгәртү статистик әһәмияткә ия булган, ике койрыклы т-тест ярдәмендә, һәм протеин матчлары эчтәлекне үзгәртү> 2 (башкача күрсәтелмәгән булса) һәм ap бәясе <0.05 белән билгеләнде.使用 双边 t 检验 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 2 0.05 0.05 2 0.05 2 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05使用 双边 t 检验 0.05 0.05 2 0.05 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0.05 2 2 0.05 0.05 0.05 2 0.05 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием дву зононнего т-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания> 2 (если не укачо ино. Протеин эчтәлегенең катлаулы үзгәрүләренең статистик әһәмияте ике койрыклы т-тест ярдәмендә сыналды, һәм протеин матчлары эчтәлекне үзгәртү өчен билгеләнде> 2 (башкача күрсәтелмәгән булса) һәм p-кыйммәтләре <0.05.Протеиннарның үзара бәйләнешен анализлау GO анализы ярдәмендә String мәгълүмат базасы белән башкарылды.
Өч биологик реплика шундый ук нәтиҗәләр белән башкарылды.Статистик анализ GraphPad Prism (GraphPad программа тәэминаты) белән эшләнде һәм Персеус белән вулкан участоклары ясалды (v1.6.15.0).Ике төркемне чагыштыру өчен, p-кыйммәтләре ике койрыклы Студентның т-тесты ярдәмендә билгеләнде.Эксперимент төркемендә ким дигәндә ике тапкыр билгеләнгән синглтон белгечләре генә вулкан участокларына кертелде, һәм контроль төркемдәге тиешле югалган кыйммәтләр Персеус белән гадәти таратудан p-кыйммәтен исәпләү өчен алыштырылды.Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.Статистик анализ өчен протеомик анализларда ким дигәндә ике биологик репликада барлыкка килгән аксымнар күплеге сакланган.Статистика ысуллары үрнәк күләмен алдан билгеләү өчен кулланылмады.Тикшеренүләр очраклы түгел.Тикшерүчеләр эксперимент һәм нәтиҗәләрне бәяләү вакытында биремнәрне күрмәделәр.
Өйрәнү дизайны турында күбрәк мәгълүмат алу өчен, бу мәкалә белән бәйләнгән Табигатьне тикшерү отчетын карагыз.
Бу тикшеренүдә алынган масса спектрометрия мәгълүматлары ProteomeXchange консорциумына iProX57 партнер репозитариясе аша ID PXD034811 (PDPL-MS мәгълүматлар базасы) базасында тапшырылды.Чимал мәгълүматлары чимал файллары формасында бирелә.Бу мәкалә оригиналь мәгълүмат бирә.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Күрше белән танышу: протеин комплексларын һәм карта органеллларын характерлау өчен якынлыкка бәйле биотиниляция куллану. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Күрше белән танышу: протеин комплексларын һәм карта органеллларын характерлау өчен якынлыкка бәйле биотиниляция куллану.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Тирә-як белән танышу: протеин комплексларын һәм карта органеллларын характерлау өчен якынлыкка бәйле биотиниляция куллану. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解 邻里 ： 使用。。。。。。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Күршелекне аңлау: тирә-юньнең биологик тормышка бәйләнешен кулланыгыз.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Якынлыкны аңлау: протеин комплексларына характеристика һәм якынлыкка бәйле биотиниляция ярдәмендә органеллларның картасы.Ток.Минем фикерем.Химик.биология 48, 44–54 (2019).
Гери, Дж.Б. һ.б.Декстер энергиясен иммун күзәнәкләренә күчереп микроэнергетика картасы.Фән 367, 1091-1097 (2020).
Гертлинг, ЭЛ һ.б.Ике протеом масштаблы челтәрләр кешенең интерактомын күзәнәккә хас ремонтлауны ачыклый.184, 3022–3040.e3028 күзәнәкләре (2021).