Яңалыклар

Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Рак күзәнәкләре кәрәзле стрессны җиңәр өчен һәм алга таба да төрле механизмнар уйлап таптылар.Протеин киназ R (PKR) һәм аның протеин активлаштыручысы (PACT) - күзәнәк таралышын һәм апоптозны тыя торган төрле стресс сигналларын күзәтүче беренче җавап бирүчеләр.Ләкин, рак күзәнәкләрендәге PACT-PKR юлын көйләү билгеле түгел.Монда без озын кодсыз РНК (lncRNA) аспартил tRNA синтетаз антисенсе RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR юлын тыюда турыдан-туры катнаша һәм рак күзәнәкләренең таралуына ярдәм итә.CRISPRi 971 рак белән бәйле lncRNA-ның зур масштаблы функциональ скринкасын кулланып, без DARS-AS1 яман шеш күзәнәкләренең таралуы белән бәйле булуын ачыкладык.Шуңа күрә, DARS-AS1 ноктасы күзәнәкләр таралуны тыя һәм витродагы төрле рак күзәнәк линияләрендә рак күзәнәк апоптозын көчәйтә һәм вивода шеш үсешен сизелерлек киметә.Механик яктан, DARS-AS1 турыдан-туры PACT активлаштыру доменына бәйләнә һәм PACT-PKR үзара бәйләнешен булдырмый, шуның белән PKR активлашуын киметә, eIF2α фосфориляциясен һәм апоптотик күзәнәк үлемен тыя.Клиник яктан, DARS-AS1 күп яман шеш авыруларында киң күрсәтелә, һәм бу lncRNAның чиктән тыш кысылуы начар прогнозны күрсәтә.Бу тикшеренү PACT-PKR юлын DARS-AS1 lncRNA белән рак белән җайга салуны ачыклый һәм яман шеш авыруларын прогнозлау һәм дәвалау өчен тагын бер максат бирә.
Стресска җайлашу сәләте - яман шеш күзәнәкләренең яшәве һәм таралуының мөһим характеристикасы.Ракның тиз таралуы һәм метаболик билгеләре каты микроэнергиядә - туклыктан мәхрүм итү, гипоксия һәм аз рН - күзәнәк үлемен сигналлаштыра ала.P535, 6, 7, KRAS8, 9, һәм HIF-110, 11, 12, 13 кебек стресска сизгер геннарны тәртипкә китерү рак авыруында еш күзәтелә, шуның белән апоптозны тыя һәм исән калырга ярдәм итә.
Протеин киназ R (PKR) - мөһим стресс сенсоры һәм эукариотик инициатива факторының субунит кинасы, кәрәзле стрессны күзәнәк үлеме белән бәйләүче тәрҗемә регуляторы.PKR башта чит вируслы РНК (dsRNA) табу белән вируслы протеин дип билгеләнде.Активлашкач, PKR фосфорилатлары eIF2α вируслы һәм кәрәзле белок синтезын тыю өчен14,15,16.PACT (PKR активлаштыручы белок) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 булмаганда беренче PKR активлаштыручы протеин дип билгеләнде.PKR белән турыдан-туры бәйләнеш аша PACT төрле стрессларны (серум ачлыгы, пероксид яки арсенит белән эшкәртү) PKR һәм түбән агым сигнал юлларына күчерә.EIF2α фосфориляциясенә өстәп, PACT-арадаш PKR активлаштыру стресс реакциясе белән бәйле төрле вакыйгаларга этәрә, шул исәптән PI3K / Akt24 юлы аша үзгәртелгән редокс статусы, p5325,26 аша NF-κB27,28 транскрипцияне көйли. Стресска каршы реакциядә, таралуда, апоптозда һәм башка төп кәрәзле процессларда аларның мөһим ролен исәпкә алып, PKR һәм PACT күп авырулар өчен терапевтик максатлар вәгъдә итәләр, аеруча яман шеш 30,31,32,33.Ләкин, бу плеиотроп функциональ һәм биологик әһәмияткә карамастан, яман шеш күзәнәкләрендә PACT / PKR эшчәнлеген көйләү авыр.
lncRNAs - протеин кодлау потенциалы булмаган 200 нуклеотидтан зуррак транскрипцияләр.Геномның эзлекле проектлары меңләгән lncRNA-ны ачыклаганнан бирле, аларның биологик функцияләрен ачыклау өчен 35,36 күп көч куелды.Researchсеш барган тикшеренүләр органы күрсәткәнчә, lncRNAлар бик күп биологик процессларда катнашалар37, шул исәптән X-хромосоманы инактивлаштыру 38,39, импринт 40, транскрипция41,42, тәрҗемә 43 һәм хәтта яман шеш авыруы 44,45,46,47.Бу тикшеренүләр хәбәр иткәнчә, күп lncRNAлар PACT / PKR юлында катнашалар.Мондый тикшеренүләрнең берсе күрсәткәнчә, lncRNA ASPACT PACT транскрипциясен тоткарлый һәм PACT mRNAның атом тотуын арттыра.Башка тикшеренүләр күрсәткәнчә, lncRNA nc886 PKR белән бәйләнгән һәм аның фосфориляциясен тыя 49,50.Әлегә PACT-арадаш PKR активлаштыруны көйләүче lncRNA турында хәбәр ителмәгән.
Аспартил-ТРНА синтетаз антисенсе РНК 1 (DARS-AS1) онкогеник lncRNA51,52,53,54 итеп билгеләнде.MiP-194-5p53, miP-12952 һәм miP-532-3p51 көйләү аша, DARS-AS1 ачык күзәнәк бөер күзәнәкләре карсиномасы, калкансыман карсинома һәм кечкенә күзәнәк үпкә карсиномасы үсешенә ярдәм итә.Тонг һәм хезмәттәшләре шулай ук ​​ачыкладылар: DARS-AS1 миелома үсешенә ярдәм итә, протеинның тотрыклылыгын саклап 39 (RBM39) RNA бәйләүче мотив.Ләкин, бу lncRNAның PACT-PKR активлаштыруны көйләүдә һәм рак күзәнәкләренең стресс реакциясендә катнашуы турында бернинди тикшеренүләр дә үткәрелмәгән.
Монда без CRISPRi системасы ярдәмендә зур масштаблы югалту-экранны эшләдек һәм DARS-AS1 lncRNAның берничә төр яман шеш күзәнәкләренең таралуына ярдәм итүен ачыкладык.Моннан тыш, без төп механизмны ачыкладык: DARS-AS1 турыдан-туры PACT белән бәйләнә, PACT һәм PKR бәйләнешен тыя, түбән PKR субстраты eIF2α фосфориляциясен булдырмый һәм ахыр чиктә апоптотик күзәнәк үлемен тыя.Ахырда, безнең эш DARS-AS1 lncRNAны PACT-PKR юлын көйләүче һәм яман шеш авыруларын дәвалау һәм прогноз өчен потенциаль максат итеп күрсәтә.
Геномик профильле тикшеренүләр рак белән бәйле йөзләгән lncRNA-ны ачыкладылар.Ләкин, аларның функциясе билгеле түгел.Рак үсешендә катнашкан перспективалы lncRNA кандидатларын ачыклау өчен, без CRISPRi системасы ярдәмендә SW620 колоректаль яман шеш күзәнәк линиясендә таралуны киметү өчен функциональ экранны эшләдек (1а рәсем).SW480 һәм SW620 эчәк яман шеш күзәнәкләренең уникаль үзенчәлеге - алар бер пациентта төп һәм икенчел шешләрдән алынган.Бу алдынгы эчәк яман шешенең үсешендәге генетик үзгәрешләрне өйрәнү өчен кыйммәтле чагыштыру бирә.Шуңа күрә, без РНК эзләү ярдәмендә колоректаль яман шеш күзәнәк линияләренең транскриптомнарын анализладык һәм басылган әдәбияттан кайбер потенциаль функциональ lncRNA тупладык.Бу нәтиҗәләргә нигезләнеп, без 7355 sgRNA олигосын туплаган sgRNA китапханәсен эшләдек, 971 яман шеш авыруы белән бәйле lncRNA һәм тискәре контроль өчен 500 максатсыз sgRNA олигос (өстәмә мәгълүмат 1).
CRISPRi системасы ярдәмендә скринкның схематик чагылышы.b sgRNA баету.Горизонталь нокта сызыгы log2 (катлау үзгәреше) = ± 0.58 күрсәтә.Вертикаль нокта сызыгы p кыйммәтен күрсәтә = 0.05.Кара нокталар максатсыз sgRNAны күрсәтәләр (NC итеп билгеләнгән).Кызыл нокталар - DARS-AS1 адреслы sgRNA.Зәңгәр нокталар - sgRNAs, LINC00205, алдан тасвирланган онкогеник lncRNA.катлау үзгәреше = (нормальләштерелгән уку, 17 көн) / (нормальләштерелгән уку, 0 көн).c DARS-AS1 sgRNA бәрелү күзәнәк үсешен тоткарлады.Хата юллары - өч экспериментның стандарт тайпылышын күрсәтә.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ике койрыклы Студентның тесты.d DARS-AS1 шешләрдә белдерү (TCGA мәгълүматлар базасы).em DARS-AS1 парлы нормаль һәм шеш үрнәкләрендә BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, һәм COAD белән күрсәтелгән (TCGA мәгълүматлар базасы).p-кыйммәтләре парлы ике койрыклы Студентның т-тесты ярдәмендә алынган.
Плазмид төзеп, лентивирусны тутырганнан соң, без дүрт бәйсез инфекция экспериментында dCas9-SW620 колоректаль яман шеш күзәнәк линиясен югарыдагы китапханә белән күчердек.Бу инфекцияләр өчен инфекциянең күплеге (MOI) 0,1–0.3 булган, бу һәр күзәнәкнең бер sgRNA белән генә күчерелүен күрсәтә.18 көн витро культурасыннан соң, максатлы sgRNA-ны баету профиле скринкадан соң кимеде яки артты, максатсыз контроль олигонуклеотидлар саны алдан карау профиле белән чагыштырганда чагыштырмача үзгәрмәде, бу безнең максатның югары экранга хас булуын күрсәтә. китапханә.Дөге.1б һәм өстәмә таблица 1). Элек үпкә яман шешен һәм бавыр яман шешен пропагандалау өчен хәбәр ителгән LINC00205, бу скринкның ышанычлылыгын раслаучы (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05) тикшерелде (1б рәсем). Элек үпкә яман шешен һәм бавыр яман шешен пропагандалау өчен хәбәр ителгән LINC00205, бу скринкның ышанычлылыгын раслаучы (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05) тикшерелде (1б рәсем). LINC00205, котором ранее сообщалось, что он способствует прогрес кинованию рака легких и рака печенчи58, 59, 60, был глюлючен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение п <0,05ч) 1б). Lпкә яман шеш авыруы һәм бавыр яман шешенең үсешен пропагандалау өчен хәбәр ителгән LINC00205, бу скринкның ныклыгын раслаучы (log2 (катлау үзгәреше) <-0.58, p-value <0.05) чыгарылды (.1б рәсем) . LINC00205 之前 被 报道 进展, 5 58,59,60 ， 被 （（log2 （倍数） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 0.05 b b 1b）。 LINC00205 之前 被 报道 进展, 5 58,59,60 ， 被 （（log2 （倍数） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 0.05 b b 1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрес кинованию рака легких и печенчени58, 59, 60, был мюллючен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05ж) 1б). Элек үпкә һәм бавыр яман шеш авыруларын пропагандалау өчен хәбәр ителгән LINC00205, бу скринкның ныклыгын раслаучы (log2 (катлау үзгәреше) <-0.58, p-value <0.05) чыгарылды (1 нче рәсем).
Тикшерелгән барлык lncRNAлар арасында, DARS-AS1 шулай ук ​​тикшерелде, өч конгресс sgRNA олигонуклеотид 18 көн культурадан соң сизелерлек кимеде, бу lncRNAның бәрелүе рак таралуның кимүенә китерә (1б рәсем).Бу нәтиҗә колоректаль яман шеш күзәнәкләрендә МТС анализы белән таяныч булды, DARS-AS1 шакмак күзәнәкләренең үсеш темплары контроль күзәнәкләр белән чагыштырганда ярты тапкыр кимегәнен һәм башка берничә рак төренең алдагы хәбәрләренә туры килгәнен күрсәтте.: күзәнәк бөер яман шешен, калкансыман яман шеш һәм үпкә яман шеш күзәнәкләрен чистарту 51,52,53,55.Ләкин, аның функциясе һәм колоректаль яман шештәге молекуляр механизмнар өйрәнелмәгән булып кала.Шуңа күрә без бу lncRNAны алга таба өйрәнү өчен сайладык.
Пациентларда DARS-AS1 экспрессиясен өйрәнү өчен, без Рак Геном Атласы (TCGA) проектыннан 10,327 шеш үрнәген анализладык.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 төрле шешләрдә сәламәт күзәнәкләрдә киң чагылыш таба һәм шактый көйләнә, шул исәптән эчәк аденокарсинома (COAD), бөер чиста күзәнәк карсиномасы (KIRC), һәм бөер папилярия күзәнәк карсиномасы (KIRP)..Бик аз (1д рәсем һәм өстәмә рәсем 1а, б). Парлы сәламәт / шеш үрнәкләрен анализлау, бөер уротел карсиномасы (BLCA), бөер бөеренең чиста күзәнәк карсиномасы (KIRC), простат аденокарциномасы (PRAD), үпкә сквамлы күзәнәк карсиномасы (LUSC) шешләрендә DARS-AS1 күрсәткечләренең тагын да югарырак булуын раслады. , бөтерек корпусы эндометрия карсиномасы (UCEC), үпкә аденокарсиномасы (LUAD), бавыр гепатоселяр карсиномасы (LIHC), бөер бөер папилярия күзәнәк карсиномасы (KIRP), һәм эчәк аденокарсинома (COAD) (p бәясе <0.05) (рәсем 1e - m). . Парлы сәламәт / шеш үрнәкләрен анализлау, бөер уротел карсиномасы (BLCA), бөер бөеренең чиста күзәнәк карсиномасы (KIRC), простат аденокарциномасы (PRAD), үпкә сквамлы күзәнәк карсиномасы (LUSC) шешләрендә DARS-AS1 күрсәткечләренең тагын да югарырак булуын раслады. , бөтерек корпусы эндометрия карсиномасы (UCEC), үпкә аденокарсиномасы (LUAD), бавыр гепатоселяр карсиномасы (LIHC), бөер бөер папилярия күзәнәк карсиномасы (KIRP), һәм эчәк аденокарсинома (COAD) (p бәясе <0.05) (рәсем 1e - m). .Парлы сәламәт / шеш үрнәкләрен анализлау шулай ук ​​DARS-AS1-ның бөер уротел карсиномасында (BLCA), күзәнәк бөер һәм бөер күзәнәк карсиномасында (KIRC), простат аденокарсиномасында (PRAD), үпкә сквамлы күзәнәк карсиномасында (LUSC) шешләрдә сизелерлек югары булуын раслады., карцинома энд кампанияия мата матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоц чанюлярная карцинома паччени (LIHC), пап чарарно-клеточная карцинома куки (КИРП) һәм аденокарцин зо пл. м). , корпус баласы эндометрия карсиномасы (UCEC), үпкә аденокарсиномасы (LUAD), бавырның гепатоселяр карсиномасы (LIHC), бөернең папилярия күзәнәк карсиномасы (KIRP), һәм эчәкнең аденокарциномы (COAD) 0.05) (рәсем 1e– м).AR 健康 / 肿瘤 样本 的 AR AR AR DARS-AS1 在 膀胱 尿路 B (BLCA) 、 肾 肾 K K (KIRC) UCEC） （（EC EC LUAD） ， 肝细胞癌 （LIHC） ， 肾 IR IR IR IR IR IR <0.05） （e 1e-m）.配对 健康 / 肿瘤 ars ars dars-os1 在 尿路 ars ars p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p (лус)癌 （kirp） ad coad） （p 值 <0.05） （e 1e-m）.Сәламәт / шеш парлы үрнәкләрне анализлау, бөер уротел карсиномасында (BLCA), күзәнәк бөер күзәнәкләре карсиномасында (KIRC), простат аденокарсиномасында (PRAD), һәм үпкә сквамлы күзәнәк карсиномасында (LUSC) шешләрдә DARS-AS1 ролен тагын да ныгытты.за при при карциноме за матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоц чюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной пап чарярно-клеточной карциноме (КЫРП) и зеденчочк. -м). корпус баласы карсиномасында (UCEC), үпкә аденокарсиномасында (LUAD), гепатоселяр карсиномасында (LIHC), бөер папилярия күзәнәк карсиномасында (KIRP), һәм эчәк аденокарсиномада (COAD) (p бәясе <0.05) (рәсем 1e -m).Бергә тупланган бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 төрле яман шеш авыруларында киң һәм югары чагылыш таба.
DARS-AS1 һәм DARS (антисенс полосасын кодлаучы ген) бер үк промоутерны уртаклашканга һәм бер-берсенең янында урнашканга, без DRNA-AS1ны махсус бәреп төшерү өчен shRNA эшләдек, ләкин DARS түгел (өстәмә рәсем 2а, б һәм өстәмә таблица 2) .SW620-га өстәп, без шулай ук ​​shRNA ноктасының эффективлыгын һәм функциясен өйрәнү өчен DARS-AS1-ны югары күрсәтүче тагын өч күзәнәк сызыгын кулландык (өстәмә таблица 3).Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, барлык өч shRNA да ким дигәндә 80% DARS-AS1 сүндерү эффективлыгына ирешкән, DARS mRNA күләменә аз тәэсир итә (өстәмә рәсем 2c - f).Моннан тыш, без бу shRNA-лар белән DARS-AS1 сугылуы колоректаль яман шеш күзәнәк линияләрендә SW620 (49,7%) һәм HCT116 (27,7%), күкрәк яман шеш күзәнәк линиясе MBA-MD-231 (53,4%) күзәнәк үсешен сизелерлек тоткарладык.) һәм HepG2 гепатома күзәнәк линиясе (92,7% кыскарту), шулай ук ​​аларның сакланмаган өлкәләр формалаштыру сәләте (уртача кимү ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% һәм 75,7% күзәнәк сызыгы) (2а рәсем, б).SW620-да, колония формалаштыру анализы нәтиҗәләре тагын бер кат раслады: DARS-AS1 shRNA уртача 69,6% кимү белән күзәнәк таралышын сизелерлек тоткарлады (2с рәсем).
Контроль shRNA һәм DARS-AS1 shRNA күзәнәкнең таралуына (а) һәм сфероид формалашуга (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231, һәм HepG2 күзәнәкләренә тәэсире.c контроль shRNA һәм DARS-AS1 shRNAның SW620 күзәнәкләрендә колония формалашуына тәэсире.Күзәнәкләрнең таралуы (г), сфероид формалашуы (e), һәм SW620 күзәнәкләренең колония формалашуы (f) DARS-AS1 чиктән тыш кысу.Күрсәтелгән мәгълүматлар - өч экспериментның уртача ± стандарт тайпылышы.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, һәм *** p ≤ 0,001 ике койрыклы Студентның тесты.
Функциональ югалтуларны тулыландыру өчен, без SW620 күзәнәкләрен DARS-AS1 чиктән тыш кысучы ясадык (өстәмә рәсем 2г).DARS-AS1 чиктән тыш кысылу күзәнәк үсешен (1,8 тапкыр), резервланмаган сфероид формалашуны (1,4 тапкыр), һәм SW620 күзәнәкләрендә колония формалашуны (3,3 тапкыр) сизелерлек арттырды (2d - f).Бу нәтиҗәне без тагын бер DARS-AS1 күзәнәк сызыгын кулланып расладык, A549.DARS-AS1 чиктән тыш кысылу аркасында бу күзәнәкнең таралуы тагын да A549 күзәнәкләрендә күзәтелде (өстәмә рәсем 2с, i һәм өстәмә таблица 3).Бергә тупланган бу табыш һәм югалту тикшеренүләре шуны күрсәтә: DARS-AS1 витрода яман шеш күзәнәкләренең таралуына ярдәм итә.
DARS-AS1 күзәнәк таралышын җайга салучы төп механизмны барлау өчен, без аның протеинны бәйләүче партнерларын ачыклау өчен РНК чыгару анализы ясадык.RT-qPCR нәтиҗәләре күрсәткәнчә, DARS-AS1ның якынча 86,2% SW620 күзәнәкләренең цитоплазмасында урнашкан (өстәмә рәсем 3а).Витро транскрипцияләнгән биотинилатланган DARS-AS1 яки псевдоРНА аннары SW620 күзәнәк лизатлары белән инкубацияләнде, аннары SDS-PAGE аеру.Соңгы көмеш буяу күрсәткәнчә, аерым полоса (~ 38 kDa) DARS-AS1 тарту үрнәкләрендә шактый баетылган, ләкин РНК яки бусы үрнәкләрендә түгел (3а рәсем).Бу тасма масса спектрометрия (MS) белән PKR активлаштыручы протеин (PACT) дип билгеләнде һәм SW620, HCT116, һәм HepG2 күзәнәк линияләрендә иммуноблоттинг белән расланды (3а рәсем, б).DARS һәм аңа бәйле PACT белгечләрен баету - PKR һәм TRBP - шулай ук ​​Көнбатыш блотлау (WB) РНК анализы ярдәмендә тикшерелде.Нәтиҗә күрсәткәнчә, DARS-AS1 RNA һәм бу өч протеин арасында туры бәйләнеш табылмаган (өстәмә рәсем 3б).DARS-AS1 һәм PACT арасындагы үзара бәйләнеш тагын бер кат РНК иммунопрепипитациясе (RIP) анализы белән расланды, бу DARS-AS1 анти-PACT антителаларында сизелерлек баетылганын күрсәтте, ләкин башка контроль РНКлар түгел (3c рәсем).Башка кәрәзле компонентлар булмаганда DARS-AS1 турыдан-туры PACT белән үзара бәйләнештә тору-булмавын ачыклау өчен, чистартылган PACT ярдәмендә витро биолайер интерферометрия (BLI) анализы ясалды.Биотин маркалы DARS-AS1 яки РНК стрептавидин (SA) биосенсорларында мобилизацияләнде, аннары 1 μM PACT булган кинетик буферда инкубацияләнде.Шунысы игътибарга лаек, PACT DARS-AS1 (KD бәясе ~ 26.9 nM) белән нык бәйләнгән, ләкин РНКны охшатмаска (3 нче рәсем).Бергә тупланган бу нәтиҗәләр DARS-AS1 һәм PACT арасында туры бәйләнешне һәм югары якынлыкны күрсәтәләр.
РНК тарту анализы DARS-AS1 SW620 күзәнәкләрендә PACT белән үзара бәйләнештә булуын ачыклады.Oveгарыда, бәйләнешле протеиннарның көмеш буяулары.Түбән иммуноблотлар анти-PACT антителасы белән башкарылды.b РНК тарту анализы HCT116 (өске) һәм HepG2 (аскы) күзәнәкләрдә башкарылды.PACT баету иммуноблоттинг ярдәмендә ачыкланган.cRNA иммунопрекипитация (RIP) анализлары SW620 күзәнәкләрендә күрсәтелгән антителалар ярдәмендә башкарылды.d тулы озынлыктагы DARS-AS1 яки контроль РНК белән бәйләүче кәкреләр биолайер интерферометриясе (BLI) ярдәмендә алынган.РНК стрептавидин биосенсорында мобилизацияләнгән.Ассоциацияне үлчәү өчен 1 μM PACT кулланылды.e РНК тарту анализы биотинилатланган тулы озынлыктагы DARS-AS1 яки киселгән (өске) ярдәмендә башкарылды.Иммуноблот PACT күрсәткән (аста).f Чистартылган флаглы PACT биотинилатланган тулы озынлыктагы DARS-AS1 белән инкубацияләнде яки витро RIP анализы өчен киселгән (e кебек).Алынган РНК RT-qPCR тарафыннан расланган.g PACT өчен төрле РНК фрагментларының чагыштырмача якынлыгы биолайер интерферометриясе ярдәмендә алынган.Анализ өчен 100 nM RNA һәм 1 μM RAST кулланылды.h In vitro RIP анализлары чистартылган яки PACT маркалы киселгән ярдәмендә башкарылды.Алынган РНК RT-qPCR тарафыннан расланган.i SW620 күзәнәкләренең үсеш темплары DARS-AS1, PACT яки икесен дә чиктән тыш кысу.j SW620 күзәнәкләрендә тулы озынлыктагы яки киселгән DARS-AS1 чиктән тыш кысылу күзәнәк үсешенә төрле йогынты ясады.k Апоптоз анти-PARP антителасы белән иммуноблоттинг ярдәмендә ачыкланган.l DARS-AS1 ноктасы агым цитометриясе күрсәткәнчә SW620 күзәнәкләренең апоптозын китерә.Күрсәтелгән мәгълүматлар - өч экспериментның уртача ± стандарт тайпылышы. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001, ике койрыклы Студент тесты белән. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001, ике койрыклы Студент тесты белән. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ике койрыклы Студентның тесты. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t。。 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t。。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ике койрыклы Студентның тесты.
Аннары без PACT ассоциациясе өчен кирәк булган DARS-AS1 өлкәсен ачыклау өчен витро транскрипция ярдәмендә өч биотинилатланган DARS-AS1 RNA фрагментлары ясадык (3 нче рәсем).РНК анализы нәтиҗәләре күрсәткәнчә, һәр фрагмент PACT белән үзара бәйләнештә булган, ләкин 3′-терминал өлкәсе (А3 дип язылган 384–768 нуклеотид) А1 дип язылган 1–384 нуклеотидны күрсәткән) (3e рәсем).Охшаш нәтиҗәләр рекомбинант PACT ярдәмендә витро RIP анализында күзәтелде (3 нче рәсем).Бу нәтиҗәләргә туры китереп, иммобилизацияләнгән РНК фрагментларын BLI кулланып PACT белән бәйләү тәҗрибәләре шулай ук ​​күрсәтте, PACT A3 (384–768 nt) (KD бәясе якынча 94,6 nM), ләкин башка өлкәләр белән бәйләнеш юк диярлек.(3 нче рәсем).
Без шулай ук ​​PACT белән бәйләнгән бәйләүче төбәкләрне тикшердек.PACT өч функциональ доменны үз эченә ала, аларның икесе ике катлы РНК бәйләүче доменнар (dsRBD) һәм өченче домен (билгеләнгән D3) протеинның үзара бәйләнешен активлаштыручы ролен башкара.Domainәр доменның lncRNA бәйләү сәләтен тикшерү өчен, без өч доменның һәрберсен бетергән һәм витро RIP анализ ясаган өч мутация эшләдек.Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, PACT өченче доменын (D3) бетерү, аның DARS-AS1 белән үзара бәйләнешен сизелерлек киметте (бүтән PACT белән чагыштырганда 0,11 тапкыр), калган ике мутация белән чагыштырганда (3с рәсем), чыгарылыш күрсәтелде D3 DARS белән үзара бәйләнештә.-AC1.Бергә туплангач, бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 һәм PACT арасындагы үзара тәэсир беренче чиратта DARS-AS1 3 ′ ахыры һәм PACT D3 домены аша булырга мөмкин.
Без DARS-AS1 PACT экспрессиясенә һәм PACTның DARS-AS1 тәэсир итмәвен искәрттек (өстәмә рәсем 3c).Аннары без PACT ноктасының күзәнәк үсешенә тәэсирен тикшердек.DARS-AS1-дән аермалы буларак, PACT җимерелгәндә чагыштырма күзәнәкләр 1,5-3 тапкыр тизрәк үсә (өстәмә рәсем 3d).Колония формалаштыру анализы күрсәткәнчә, күзәнәкләр PACT белән shRNA белән эшкәртелгәннән соң 2-3 тапкыр колония формалашканнар (өстәмә рәсем 3e).DARS-AS1 күзәнәкләрнең таралуын PACT аша көйли, юкмы икәнлеген тикшерү өчен, без SW620 күзәнәкләрен PACT, DARS-AS1 яки икесен дә чиктән тыш кысучы ясадык.PACTның чиктән тыш кысылуы күзәнәк таралуның зур тыюлыгын күрсәтте (3 нче рәсем).DARS-AS1 чиктән тыш кысылу күзәнәк таралышын сизелерлек күтәрсә дә, DARS-AS1 һәм PACT күзәнәкләрен чиктән тыш кысу күзәнәкләренең үсеш темпында зур аерма юк иде.Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: PACT DARS-AS1 чиктән тыш кысылу аркасында арткан таралуга каршы торырга мөмкин.
DARS-AS1 төрле төбәкләренең төрле PACT бәйләү сәләтләре булганлыктан, без аларның DARS-AS1 фрагментларының чиктән тыш кысылуы белән күзәнәк таралуга чагыштырмача йогынтысын тикшердек.Калган ике фрагмент белән чагыштырганда, DARS-AS1 3 ′ очында (384–768 нт) чиктән тыш кысылды, DARS-AS1 төп PACT белән бәйле төбәк, күзәнәк таралуны стимуллаштыру өчен иң югары сәләткә ия (3j рәсем).Бу нәтиҗәләр DARS-AS1 бәйләнеш сыйфаты һәм биологик функциясе арасында уңай бәйләнешне күрсәтәләр.
PACT про-апоптотик протеин дип хәбәр ителде19.Шуңа күрә без DARS-AS1 апоптозга тәэсирен тикшердек.Көтелгәнчә, DARS-AS1 сугылуы SW620 күзәнәкләрендәге PARP ярылуын сизелерлек арттырды һәм SW620, HCT116, HepG2, һәм MBA-MD-231 күзәнәк линияләрендә V-позитив күзәнәкләр өлешен арттырды (3к рәсем).3).3f - h), DARS-AS1ның рак күзәнәкләрендәге анти-апоптотик эффектның PACT апоптоз-индуктив функциясенә капма-каршы булуын күрсәтә.Бергә тупланган бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 онкогеник функция механизмы PACT функциясен тыю аркасында булырга мөмкин.
Алга таба, без DARS-AS1-PACT ассоциациясенең функциональ нәтиҗәләрен өйрәндек.PACT турыдан-туры үзара бәйләнештә PKRны активлаштыру турында хәбәр ителде, соңрак eIF2α фосфориляциясен көчәйтә, тәрҗемә бетерүгә һәм апоптозга китерә17.Башта без DARS-AS1ның PACT һәм PKR кәрәзле локализациясенә йогынты ясавын тикшердек.Конфокаль флуоресцент микроскопия күрсәтте, PACT һәм PKR SW620 күзәнәкләрендә югары колокализацияләнгән, уртача Pearson корреляция коэффициенты 0,72.Шул ук вакытта, DARS-AS1 чиктән тыш кысылу PACT һәм PKR ко-локализациясен сизелерлек киметте (уртача Pearson корреляция коэффициенты) (4а рәсем).DARS-AS1 PACT-PKR үзара бәйләнешен модульләштерә аламы-юкмы икәнлеген тикшерү өчен, без SW620 күзәнәк лизаталарында анти-PACT антителасы белән ко-иммунопрекипитация (co-IP) анализ ясадык.PKR контроль күзәнәкләрендә анти-PACT белән бик баетылган, ә DARS-AS1 күзәнәкләрен чиктән тыш кысучы лизаталарда PKR торгызылуы сизелерлек кимегән (4б рәсем).Чистартылган маркалы PACT һәм PKR витро белок бәйләүче анализлар өчен кулланылды.Шуңа күрә, DARS-AS1 белән тәэмин итүчеләр, ләкин контроль РНК басылган PACT-PKR үзара бәйләнешне күрсәтмәделәр (Рәсем 4c).Барлык нәтиҗәләр күрсәткәнчә, DARS-AS1 PACT һәм PKR элемтәсен өзгән.
Контроль күзәнәкләрдә яки DARS-AS1 күзәнәкләрендә чиктән тыш кысучы PACT һәм PKRның локализациясе конокаль флуоресцент микроскопия ярдәмендә күзәтелде.Ядрәләр DAPI белән буялган.Статистика нәтиҗәләре 16 фотосурәттән алынган.b SW620 күзәнәкләренең лизаталарында яки DARS-AS1 күзәнәкләрен чиктән тыш кысучы күзәнәк лизаталарында анти-PACT антителасын кулланып, ко-иммунопрекипитация (co-IP).c ПАКТ маркалы, чистартылган PKR һәм витрода DARS-AS1 яки транскрипцияләнгән витро белок бәйләү анализы өчен инкубацияләнде.Иммунопрепипитация өчен флагка каршы антителалар кулланылды.d Иммуноблотлар күрсәтелгән антителалар белән SW620 һәм HCT116 күзәнәкләрендә башкарылды, контроль shRNA яки DARS-AS1-shRNA белән күчерелде, аннары серум ачлыгы.e DARS-AS1 экспрессия дәрәҗәсе кәрәзле сизгерлекне тапсигаргинга үзгәртте.SW620 күзәнәкләре DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 чиктән тыш кысылу плазмиды яки контроль плазмид белән күчерелде.Күзәнәкләр тапсигаргин белән 48 сәгать эшкәртелде һәм МТС реагенты ярдәмендә күзәнәкнең яшәешчәнлеге билгеләнде.f In vitro транскрипцияләнгән DARS-AS1 яки РНК һәм чистартылган PACT витро активлаштыру анализы һәм иммуноблотны ачыклау өчен кулланылды.g Бу антителалар кулланып иммуноблотлар SW620-ctrl күзәнәкләрендә (сулда) яки PKR мутацияләрен чиктән тыш кысучы күзәнәкләрдә (уңда) башкарылды.Аннары бу күзәнәкләр контроль shRNA яки DARS-AS1-shRNA белән күчерелде, аннары серум ачлыгы.h Агым цитометриясе күрсәткәнчә, PKR мутантын инакивацияләү SW620 күзәнәкләрендә DARS-AS1-иноподияле апоптоз өчен компенсацияләнгән.i күрсәтелгән антителалар белән иммуноблотлар SW620 (сулда) яки HCT116 (уңда) күзәнәкләрдә башкарылды.Контроль shRNA яки DARS-AS1 shRNA белән күчерелгән күзәнәкләр зарардан мәхрүм һәм 100 nM PKR C16 ингибиторы яки DMSO белән тулыландырыла.Масштаб сызыгы = 5 мм.Күрсәтелгән мәгълүматлар - өч экспериментның уртача ± стандарт тайпылышы.* p ≤ 0.05 ике койрыклы Студентның т-тесты.
Гомумән алганда, PACT PKR17 белән үзара бәйләнештә булганда, Thr451-та PKR фосфориляциясе булырга мөмкин.Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, PKR фосфориляциясе дәрәҗәсе зарарлы ачлыктан соң DARS-AS1 шакмакларында шактый күтәрелгән (4d рәсем һәм өстәмә рәсем 4а).Шуңа карап, без төп PKR субстрат eIF2α фосфориляциясенең DARS-AS1 shRNA белән сизелерлек артканын ачыкладык (4d рәсем һәм өстәмә рәсем 4а).Тапсигаргин - ER стрессоры, ER Ca2 + чыгаруга китерә.Тапсигаргин белән дәвалау PACTның экспрессиясен һәм активлашуына китерә, бу алга таба PKR белән үзара бәйләнештә тора һәм активлаштыра, eIF2α фосфориляциясен 18,61 арттырып апоптозга китерә.Монда, без тапсигаргинны PACT / PKR юлын стимуляторы итеп кулландык, DARS-AS1 күзәнәкләргә PACT / PKR юлын тыеп стрессны җиңәргә булыша аламы-юкмы икәнен тикшерү өчен.Без күзәттек, DARS-AS1 экспрессия дәрәҗәсе тапсигаргинга күзәнәк каршылыгы белән уңай бәйләнештә.SW620 күзәнәкләре чиктән тыш кысу DARS-AS1 тапсигаргин белән эшкәртелгәндә яхшырак исән калдылар, ә DARS-AS1 шакмаклары булган күзәнәкләр җиңелрәк булып киттеләр (4e рәсем).Бу нәтиҗәләргә туры китереп, DARS-AS1 чиктән тыш кысылу тапсигаргин-индуктив PKR фосфориляциясен киметте (өстәмә рәсем 4б).Киресенчә, тапсигаргин белән эшкәртелгәннән соң, PKR һәм eIF2α контроль күзәнәкләр белән чагыштырганда DARS-AS1 шакмак күзәнәкләрендә фосфориатлаштырылган (өстәмә рәсем 4б).Кызык, тапсигаргин DARS-AS1 экспозициясен дозага бәйле рәвештә күрсәтә, бу DARS-AS1 стресска каршы функцияне күрсәтә ала (өстәмә рәсем 4c).Моннан тыш, без бу күзәтүләрне раслау өчен витро активлаштыру анализларын ясадык.Кыскасы, PKR күзәнәк лизаталарыннан анти-PKR антителасы ярдәмендә чистартылды, аннары витрода транскрипцияләнгән рекомбинант PACT һәм DARS-AS1 белән инкубацияләнде.Энзиматик реакциядән соң, фоспо-ПКР WB ярдәмендә ачыкланган.Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, PKR фосфориляциясе DARS-AS1 тарафыннан бик нык тыелган, ләкин контроль РНК белән түгел (4 нче рәсем).Бу витро һәм виво нәтиҗәләре DARS-AS1 PACT-арадаш PKR активлаштыруны тыя.Шул ук вакытта, без шулай ук ​​DARS-AS1 булганда PACT торгызуның кимүен күрдек (4 нче рәсем).Бу нәтиҗә витро белок бәйләүче анализ нәтиҗәләре белән туры килә һәм рәсем PACT-PKR ассоциациясе өчен DARS-AS1 блоклау функциясен күрсәтә.
P24ның D3 доменындагы Ser246 һәм Ser287 кәрәзле стресс астында PKR активлаштыру өчен кирәк.Ике серин калдыкларын аланинга алыштыру мутант PACT (mutD) бирде, ул стресс булмаганда PKRны активлаштырды, һәм аланинны (mutA) алыштыру протоколны кире какты.Бу доменның DARS-AS1 белән турыдан-туры бәйләнештә булуын күрсәткәнгә, без бу ике PACT мутанты ясадык, бу калдыкларның DARS-AS1 белән үзара бәйләнештә катнаша алуын тикшерү өчен.Кызык, ике мутант DARS-AS1 белән бәйләү сәләтен югалттылар (өстәмә рәсем 4d), DARS-AS1 белән эффектив үзара бәйләнеш өчен PACT белокының тулы структурасы таләп ителергә мөмкин.
Моннан тыш, безнең нәтиҗәләр шулай ук ​​DARS-AS1-shRNA-күзәнәк таралышын ингибацияләү доминант тискәре PACT мутанты (PACTmutA) яки доминант тискәре PKR мутанты (PKRmut) чиктән тыш кысылу белән өлешчә торгызылырга мөмкинлеген күрсәтә (өстәмә рәсем 4e. E).Доминант-тискәре PKR мутацияләренең чиктән тыш кысылуы DARS-AS1 бәрелү аркасында PKR фосфориляциясен киметте, шулай ук ​​зарарлы күзәнәкләрдә eIF2α фосфориляциясен (4г рәсем).Иң мөһиме, PKRmutны чиктән тыш кысучы күзәнәкләрдә DARS-AS1 бәрелү аркасында китерелгән апоптотик күзәнәкләрнең өлеше кимеде (4с рәсем һәм өстәмә рәсем 4г).PKR киназ эшчәнлеген тыю шулай ук ​​DARS-AS1 функциясенә комачаулый, чөнки нәтиҗәләр күрсәткәнчә, DARS-AS1 сугылу PKR һәм eIF2α фосфориляциясен сирәк китерә, күзәнәкләр PKR-махсус C16 ингибиторы белән эшкәртелгәндә (4i рәсем һәм өстәмә рәсем 4h).).Бергә тупланганнан соң, безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 күзәнәк таралуга ярдәм итә, ким дигәндә өлешчә, PACT-арадаш PKR активлаштыруны тыеп.
Алга таба туморигенезда DARS-AS1 ролен өйрәнү өчен, без тычкан ксенографты моделе ярдәмендә виво экспериментларда чыгыш ясадык. Нәтиҗә шуны күрсәтә: DARS-AS1 сугылуы тычканнарда шеш үсешен кискен киметте (p бәясе <0.0001) (5а рәсем). Нәтиҗә шуны күрсәтә: DARS-AS1 сугылуы тычканнарда шеш үсешен кискен киметте (p бәясе <0.0001) (5а рәсем). Результатя показывают, что аддаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мшейей (значение б <0,0001) (рис. 5а). Нәтиҗә шуны күрсәтә: DARS-AS1 сугылуы тычканнардагы шеш үсешен кискен киметә (p бәясе <0.0001) (рәсем 5а).AR 表明 AR DARS-AS1 的 敲 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.AR 表明 AR DARS-AS1 的 敲 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. Результатя показали, что Кададаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мшейей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Нәтиҗә күрсәткәнчә, DARS-AS1 бәрелү тычканнардагы шеш үсешен сизелерлек киметкән (p бәясе <0.0001) (рәсем 5а).Шулай итеп, DARS-AS1 сугылу төркемендә уртача шеш күләме якынча 72,9% ка, уртача шеш массасы якынча 87,8% ка кимеде (5б-д рәсем).Бу нәтиҗәләр DARS-AS1 вивода шеш үсешен сизелерлек күтәрә алуын күрсәтә.
Яланаяклы тычканнардагы колоректаль онкогенезга DARS-AS1 рекламасының эффектлары.Curсеш сызыклары (а), шеш зурлыгы (б), авырлык (в), шеш рәсемнәре (г) күрсәтелә.Хата барлары ± SEMны күрсәтә. n = 10. **** p <0.0001, ике койрыклы Студент тесты белән. n = 10. **** p <0.0001, ике койрыклы Студент тесты белән. n = 10. **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. n = 10. **** p <0.0001 ике койрыклы Студентның тесты.n = 10. **** р <0.0001 ， 通过 双 尾 学生。。 **** р <0.0001 ， 通过 双 尾 学生。。 **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. **** p <0.0001 ике койрыклы Студентның т-тесты.e Каплан-Мейер DARS-AS1 экспрессия дәрәҗәсе һәм UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, LGG авыруларында гомуми исәнлек арасындагы бәйләнешне анализлады.Пациентларда югары дәрәҗәдәге DARS-AS1 экспрессиясе иң яхшы 50% иде;пациентларда DARS-AS1 экспрессиясенең түбән дәрәҗәсе 50% иде.p-кыйммәтләр журнал дәрәҗәсе тесты ярдәмендә билгеләнде.f DARS-AS1 PACT-PKR юлын һәм шеш үсешен көйли торган тәкъдим ителгән модель.
DARS-AS1 клиник йогынтысын яхшырак аңлау өчен, без аның чагылышы һәм пациентларның исән калулары арасындагы бәйләнешне тикшердек.TCGA мәгълүматлар базасын анализлап, без югары DARS-AS1 экспрессиясенең увел меланомасы (UVM), бөер хромофобиясе (KICH), бөер папилярия күзәнәк карсиномасы (KIRP), месотелия (MESO), мультиплекс белән бәйле булуын ачыкладык.Түбән исән калу глиобластома морфозы (ГБМ) һәм түбән дәрәҗәдәге ми глиомасы (LGG) белән авыручылар белән бәйле иде (5e рәсем).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 клиник шеш үсешендә мөһим роль уйный ала һәм берничә яман шештә биомаркер булырга мөмкин.
Бу тикшеренүдә, зур масштаблы CRISPRi функциональ скринкасын кулланып, без DARS-AS1 lncRNAның ике төп стресс респондентын, PACT һәм PKR көйләп, яман шеш күзәнәк стрессын җиңүен ачыкладык.PACT белән турыдан-туры бәйләнештә, DARS-AS1 PACT-арадашлы PKR активлаштыруны тыя, шуның белән апоптотик күзәнәк үлемен булдырмый һәм күзәнәк таралышына ярдәм итә (5ф рәсем).DARS-AS1 регуляциясе ракның берничә төрендә күзәтелә, аның рак күзәнәкләренең стресслы шартларда яшәвен пропагандалау функциясе ракның күп төрләренә киң кулланылырга мөмкинлеген күрсәтә.
PACT PKR активлаштыручы протеин дип билгеләнде, һәм PACT-арадаш PKR активлаштыру транскрипция, тәрҗемә, апоптоз һәм башка мөһим кәрәзле процессларны көйләп стресс реакцияләрендә мөһим роль уйный62.Дистә еллар дәвамында PACT-PKR каскадының яман шеш авыруларын көйләү омтылышлары ясалды.Монда, безнең тикшерү рак күзәнәкләрендә PACT-PKR көйләүнең башка механизмын ачты, ул турыдан-туры PACT белән бәйләнгән, PACT-PKR үзара бәйләнешне тыя, PKR активлашуын һәм eIF2α фосфориляциясен тыя, шуның белән стресска китерелгән апоптозны һәм тыелган апоптозны тыя. ахыр чиктә яман шеш таралуны стимуллаштыру.күзәнәкләр.Бу ачыш ракны прогнозлау һәм терапия өчен потенциаль lncRNA максатларын яктырта.
Безнең мәгълүматлар күрсәткәнчә, DARS-AS1 шакмаклары фосфориатланган PKR һәм eIF2α арту белән күзәнәкләрне ач ачуга сизгерли.Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DARS-AS1 авыр шартларда рак күзәнәкләренең яшәешенә ярдәм итә, PACT / PKR эшчәнлеген тыеп.ASPACT һәм nc886 кебек башка берничә кодсыз РНКлар да PACT48 PKR күчәрендә катнашалар, PACT48 mRNA-ны регуляцияләү яки PKR49,50,64 белән бәйләп автофосфориляцияне көйләү.Алар арасында, DARS-AS1 PACT-PKR ассоциациясен бозучы ролен башкара.Бу тикшеренү PACT / PKR күчәрен көйләү һәм стресс реакцияләрендә lncRNAларның ролен аңлавыбызны баета.
PACT өч аерым доменны үз эченә ала.Беренче ике dsRBD-ның һәрберсе PACT-ның PKR белән югары бәйләнешенә ирешү өчен җитә, өченче домен (D3) PKR-ны витрода һәм вивода активлаштыру өчен кирәк.Безнең тикшерү күрсәткәнчә, DARS-AS1 D3 домены белән өстенлек итә (3 нче рәсем).LncRNA (768 нуклеотид) зурлыгын исәпкә алып, D3 белән бәйләнгән DARS-AS1 dsRBD һәм PKR домены арасындагы үзара бәйләнешне физик яктан тыя ала, шуның белән PACT һәм PKR ассоциациясен блоклый.D24-та Ser246 һәм Ser287-ны аланин яки аспартат белән алыштырган PACT ноктасы мутацияләре DARS-AS1 өчен бәйләнешне бозды, D3-ның гомуми структур һәм электр үзлекләренең ассоциациясендә мөһимлеген күрсәтте.Бу механизмның өстәмә детальләре киләчәктә төгәл биохимик анализ һәм югары резолюцияле PACT структур анализ кулланып кулланылачак.
Элеккеге тикшеренүләр хәбәр иткәнчә, DARS-AS1 берничә механизм ярдәмендә күзәнәк таралуга ярдәм итә51,52,53.Бер мисалда, тикшерүчеләр күзәттеләр: DARS-AS1 аның антисенс белок-кодлау DARS генын бөер яман шеш күзәнәкләрендә miP-194-5p максат итеп туплаган.Ләкин, хәзерге тикшеренүдә, DARS-AS1 бәрелү DARS транскрипциясенә бик аз тәэсир итте, ким дигәндә колоректаль, күкрәк һәм бавыр яман шеш авыруларын.LncRNAs күзәнәк һәм тукымаларга хас булган экспресс формаларын күрсәткәнгә, функциональ механизмнар рак төрләре буенча сакланырга мөмкин түгел, бу безнең күзәтүләр һәм төрле яман шешләрне алдагы бәяләүләр арасындагы тигезсезлеккә ярдәм итә ала.Төрле физиологик һәм патологик процессларның конкрет механизмнарын ачыклау өчен махсус тикшеренүләр кирәк.
Клиник мәгълүматларга анализ күрсәткәнчә, шешләрдә DARS-AS1 экспрессиясе яман шеш авыруларының яшәве белән капма-каршы бәйләнештә тора, бу DARS-AS1 / PACT / PKR күчәренең рак прогнозында мөһимлеген күрсәтә.Ахырда, безнең тикшерү шуны күрсәтә: DARS-AS1 PACT / PKR сигнал күчәрен көйләүче, яман шеш күзәнәкләренең таралуына ярдәм итә, һәм стресс реакциясе вакытында апоптозны тыя, бу тагын бер тикшеренү линиясе бирә һәм киләчәктә потенциаль дәвалау ысуллары өчен кызыклы. .
Кеше күзәнәк линияләре SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 һәм HEK293T Кытайдагы Милли күзәнәк линиясе ресурс инфраструктурасыннан алынган.Барлык күзәнәкләр дә DMEM уртада сакланган (DMEM, Термо Фишер Фәнни, Уолтам, MA) 10% FBS (Егетләр, Бруклин, Нью-Йорк) һәм 1% пенициллин-стрептомицин (Термо Фишер Фәнни) 37 ° C, 5% CO2 белән тулыландырылган.инкубатор.
Анти-ПАКТ, Абкам (ab31967);Анти-ПКР, Абкам (ab184257);Анти-ПКР (фоспо-Т451), Абкам (ab81303);Флагка каршы, Абкам (ab125243);Анти-eIF2α, Абкам (A0764));анти-eIF2α (фосфор S51), Абкам (ab32157);анти-ПАКТ (фосфор S246), Абгент (AP7744b);анти-tub-тубулин, КСТ (2128);гадәти тычкан IgG, CST (5415S);нормаль куян IgG, CST (2729С).Антителалар Көнбатыш блотлау өчен ПБСТта 1: 1000 һәм IP өчен 1: 100 эретелде.
sgRNAлар CRISPR-ERA66 дип аталган корал ярдәмендә эшләнде.Без sgRNA үсеше өчен демократик корал параметрларын кулландык һәм алгоритм исәпләнгән sgRNA бәйләүче сайтларны 3 кб өлкәсендә кулландык.TSS үзәгендә.SgRNA олигонуклеотид бассейннары CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) синтезланган һәм гуманлаштырылган pgRNA плазмидларына клонланган (Аддген 44 44248).Барлыгы 12 µг тупланган гуманизацияләнгән pgRNA плазмид, 7,2 µг psPAX2 (Аддген # 12260), һәм 4,8 µg pMD2.G (Аддген # 12259) 5 с 106 HEK293T белән 10 см савытта DNAfect Transfection Reagent ярдәмендә күчерелде. күзәнәкләр (CWBIO, Пекин, Китай) җитештерүче күрсәтмәсе буенча.Вируслы супернантлар 48 һәм 72 сәгатьтән соң җыелган һәм 0,45 мм фильтр аша фильтрланган.Тикшерү өчен, dCas9 / KRAB кушылу протеинын күрсәтүче SW620 күзәнәкләре вирус трансдукциясе ярдәмендә алынган.Модификацияләнгән SW620 күзәнәкләре вирус китапханәсе белән дүрт бәйсез инфекция экспериментында MOI 0,1-0,3 тәэсирендә зарарландылар һәм 2 μг / мл пуромицин (Сигма, Сент-Луис, МО) белән 2 көн үрнәк алдылар.Аннан соң, күзәнәкләр 18 көн дәвамында витрода культуралы булдылар, минимум китапханәдә 500 күзәнәк / sgRNA скринка өчен.
Геном ДНК QIAamp DNA кан миди комплекты күрсәтмәсе буенча алынган (QIAGEN, Дюссельдорф, Германия; 51183).Гомумән алганда, китапханә төзү өчен биологик кабатлау өчен 100 μг геном ДНК кулланылды.SgRNA өлкәсе ике тур PCR белән көчәйтелде һәм штрих-код белән бәйләнде.
PCR продуктлары NucleoSpin® гел һәм PCR чистарту комплекты ярдәмендә чистартылды (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Германия; 740609.250) һәм Qubit ™ HS ике катлы ДНК ачыклау комплекты ярдәмендә күләмләнде (Термо Фишер Фәнни; Q32854).
МТС анализы күзәнәк таралышын үлчәү өчен кулланылды.Күзәнәкләр 2000 кое / кое башлангыч тыгызлыгында 96 кое тәлинкәләргә чәчелгән.Күзәнәкләрнең чагыштырмача саны күрсәтелгән вакытта көн саен барлыгы 4-6 көн үлчәнде.Eachәр скважина өчен 20 μл МТС реагенты (Промега) 100 μл DMEM белән эретелде, күзәнәкләр белән 4 сәг. 37 ° C, аннары OD490 үлчәнде.
Сакланмаган үсеш мөмкинлеге сфераларның формалашуын анализлап ачылды.Кыскасы, shRNA DARS-AS1 яки контроль shRNA белән күчерелгән 2000 күзәнәк ультра түбән бәйләнешле микроплиталарда (Corning) 4 көн саен уртача үзгәрешләр белән культураланган.Сфероидлар 14 көннән соң саналды.DARS-AS1 чиктән тыш кысылу плазмиды яки контроль плазмид белән күчерелгән 500 күзәнәк көчәйтү анализы өчен кулланылды, югыйсә ысул үзгәртелмәгән.
РНА Riboprobe® комбинация системалары (Промега P1440) күрсәтмәсе буенча T7 RNA полимераз һәм биотин-16-UTP (Roche 1138908910) ярдәмендә транскрипцияләнде.Монда кулланылган праймериз өстәмә таблицада күрсәтелгән.
Протеин-кодлау PACT яки PKR өлкәләре pET15b (Аддген 73 73619) клонланган һәм BL21 (DE3) итеп үзгәртелгән.Бактерияләр амбициллин белән тәэмин ителгән LBда төнлә инкубацияләнде, аннары яңа LB белән 100 тапкыр эретелде.ОД600 уртача 0,8гә җиткәч, протеин экспрессиясен җибәрү өчен 1 мм IPTG кушылды.Төнлә йомшак селкенү белән инкубациядән соң (250 ° 20 ° C), күзәнәк пелеле центрифугация белән җыелды (4000 әйләнеш, 10 мин, 4 ° C).Лизис буферында (50 мм Трис, pH 8.0, 250 мм NaCl, 1 мм PMSF) күзәнәк пелелетын торгызыгыз һәм бозда 30 минут инкубацияләгез, аннары соникат (15 мин, 5 с / боз, боз) һәм центрифуга (13,000) rpm)., 30 мин, 4 ° С).Супернатант Ni-NTA резинасына (QIAGEN) 3 тапкыр 4 ° C ка йөкләнде, юу буферы белән 4 тапкыр юылды (50 мм Трис, pH 8.0, 40 мм имидазол, 250 мм NaCl) һәм 3 тапкыр сузылды, барлыгы 10 мл элуент буфер (50 мм Трис, pH 8.0, 250 мм NaCl, 300 мм имидазол).Чистартылган протеин WB ярдәмендә билгеләнде һәм концентрация Qubit ™ протеин анализлау комплекты ярдәмендә билгеләнде (Термо Фишер Фәнни; Q 33212).
RIP анализлары модификацияләр белән алдан әйтелгәнчә башкарылды.Кыскасы, 1x RIP буферы (25 мм Tris-HCl, pH 7.5, 100 мм NaCl, 0,5% NP-40, РНасин рибонуклаз ингибиторы (Промега), PMSF (Бейотим биотехнологиясе), 1 мм DDM, протеаз) цитостатик 1 х 107 коктейль (Роче, 1 мм DTT) һәм центрифуга 13,000 әйләнештә 15 минутта 4 ° C.Шуннан соң супернатант 5 μг анти-PACT антителасы (Abeam) яки IgG (CST) белән кушылган A + G магнит мишәр (Миллипор) белок белән инкубацияләнде.Мончалар 5х RIP буферы белән 5 тапкыр юылган, аннары протеиназ K (NEB) белән сеңдерелгән.РНА Тризол белән алынган һәм RT-qPCR белән билгеләнгән.Праймерлар өстәмә таблицада китерелгән.
Витро RIP анализы үзгәртелгән стандарт RIP анализ протоколы нигезендә башкарылды.Барлыгы 5 сәгать витро транскрипцияләнгән РНК 1х RIP буферы белән эретелгән һәм 65 ° C инкубация белән 5 минут эчендә аннальланган, аннары бүлмә температурасына әкрен суытылган.Барлыгы 5 сәгать тулы яки мутацияләнгән флаглы PACT белгечләре Э.Колидан чистартылды.Ренатурацияләнгән РНК белән 2 сәгать 4 ° C инкубацияләгез һәм флагка каршы IP өчен RIP анализы өчен югарыдагы процедураны үтәгез.
РНК киңәйтү анализы өчен 1 × 107 күзәнәк 1xRIP буфер белән лизизланган.13000 минутта 4 минутта 15 минутта центрифугациядән соң, супернатант 30 μл стрептавидин магнит мишәрләре (Бекман) белән 4 сәг.Чистартылган лизат аннары чүпрә tRNA белән тәэмин ителде һәм төнлә 4 ° C температурада 40 pmol үзгәртелгән РНК белән инкубацияләнде, аннары тагын 2 сәгать һәм 20 μл яңа стрептавидин магнит бусы кушылды, BSA белән блокланган.Wasу адымы 5 тапкыр RIP буферы белән 4 тапкыр, 1х RIP буферы белән 4 тапкыр торды.Тиешле протеиннар биотин элита буферы белән ясалганнар (25 мм Tris-HCl, pH 7.5, 12,5 мм D-биотин, PMSF) һәм NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) белән аерылды.Көмеш буяудан соң (Бейотим Биотехнология), кайбер төркемнәр MS тарафыннан акцизланган һәм анализланган.
Co-IP анализ PACT һәм PKR арасындагы үзара бәйләнешне сынау өчен башкарылды.Кыскасы, супернатант лизатлар 1 x RIP буферында 1 x 107 лизланган күзәнәкләрне инкубацияләп әзерләнделәр, аннары центрифугация 13000 әйләнештә 15 минутта 4 ° C.Лизатлар A + G магнитлы протеиннар белән тутырылган, 5 µг анти-PACT антителасы белән кушылган һәм төнлә 4 ° C температурада әкрен әйләнгән.Мончалар 3 × RIP буферы белән 3 тапкыр юылды, ике тапкыр 1 × RIP буферы белән һәм 1 × SDS буферы белән чистартылды.Алынган протеин SDS-PAGE гели белән анализланган һәм WB тарафыннан ачыкланган.
Э.Колидан ике төнге флаглы PACT һәм 1 pmol PKR чистартылды.1 × RIP буферында эретегез һәм 10 сәгать 4 минутта 4 ° C температурада үзгәртелгән РНК белән инкубацияләгез.Аннан соң, алар өстәмә ике сәгать дәвамында A + G магнит мишәр-коньигуацияләнгән анти-маркалы антитела белән инкубацияләнделәр.Моннан соң мончалар дүрт тапкыр 1х RIP буферы белән юылды һәм 1х SDS буферы белән чистартылды.Нәтиҗә ясалган PACT һәм PKR WB тарафыннан ачыкланган.